抗病毒蛋白PKR的结构和功能①

夏 君 综述 谢 炯 张 萍 审校

(中山大学中山医学院免疫学教研室 热带病教育部重点实验室，广州510080)

病毒感染后，细胞合成分泌大量的干扰素(Interferon，IFN)，这些IFN通过自分泌或旁分泌的方式与细胞膜上的受体结合，激活STAT/JAK信号级联反应，调控300多个干扰素调控基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的转录翻译水平，其中包括经典的抗病毒蛋白PKR。PKR即双链RNA依赖性蛋白激酶，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶。dsRNA可以激活PKR，使其发生自我磷酸化，而活化的PKR进一步促进IFN的产生，也可以协同参与其他抗病毒机制，在固有免疫信号通路中发挥重要作用[1]。本文综述了近年来在PKR的结构，激活因素，功能以及与疾病关系等方面的研究进展。

1 PKR的结构

PKR基因定位于人染色体2P21-22，在鼠中定位于染色体17E2上。人的PKR由551个氨基酸组成，鼠的PKR是由515个氨基酸组成。虽然不同哺乳动物PKR的分子量和氨基酸序列存在一定的差异，但它们的分子结构是相似的。以人PKR蛋白结构为例，N端为调节结构域，有2个串联分布的dsRNA结合基序 dsRNA-binding motifs1(dsRBM1)和dsRNA-binding motifs2(dsRBM2)，分别位于 55～75aa及145～166aa区域内，dsRBM1和dsRBM2均有相似的αβββα折叠形成的模体，N端的调节结构域主要介导PKR同dsRNA的结合。C端为催化结构域，含有11个保守的激酶亚结构域，aa273到羧基末端的aa551这一区域是ATP结合区域，其中aa296位点是赖氨酸，在磷酸化反应时接收ATP。C端的催化基团主要是激酶区介导激活后的一些级联反应，如 eIF-2 α磷酸化导致蛋白合成终止等[1]。PKR与其经典的底物蛋白起始因子eIF-2 α相互作用的区域位于367～551aa，eIF-2 α与该区域的αG螺旋结合后构象发生改变使可使需要磷酸化的基团更加接近PKR C端ATP结合区域，有利于磷酸化的进行。

PKR在细胞中的存在形式至少有以下三种:无活性单体，在胞质的无活性二聚体和呈“钟形”卷曲的活性二聚体。PKR无活性构象的维持主要是依赖N端的dsRNA结合区域(dsRBD)和激酶区的PACT 结合区域(PBM)的相互作用[2]。

2 PKR的激活

PKR在细胞中一般不具有激酶活性，只有在活化物刺激活化后才能发挥作用，常见的PKR活化物包括 dsRNA、TLR配体、PACT蛋白以及细胞因子等。

2.1 RNA PKR的dsRBD能够与病毒复制产生的及人工合成的dsRNA相互结合。dsRBD与dsRNA以最适方式结合，使dsRBD从激酶区域解离开来，激酶区被活化[3]。研究发现小剂量的dsRNA促进PKR的二聚化和活化，大剂量的dsRNA反而无法激活PKR，通过dsRBD和dsRNA之间化学计量实验显示dsRNA与PKR是近似一对二的作用模式[4]，两个dsRBD即4个dsRBM，可以通过首尾相接包裹一个长的dsRNA。dsRNA的作用是将PKR单体聚拢，使激酶区接近来增强二聚化，诱导自身磷酸化。

dsRNA的长度也决定了PKR可否被活化，通常30 bp以上的dsRNA可使PKR活化，有研究报道24 bp和33 bp的dsRNA可以竞争性抑制79 bp的长链dsRNA对PKR的激活[5]，但过长的dsRNA非但不能活化反而抑制了 PKR的活性，85 bp为最适长度[3，6]。除了长度以外，RNA的结构与PKR激活也有密切的关系。目前认为，可激活PKR的RNA无序列特异性，除了经典的dsRNA外，含有凸出结构(Bulges)、内环结构(Internal loops)或者发夹结构(Hairpin)的RNA均可激活PKR。通过特殊结构dsRNA库(Partially structured dsRNA library)循环搜索与PKR配对的RNA发现，库中与PKR dsRDM配对的区域都是含有茎环结构或发夹结构的短链dsRNA(Aptamers)，且这些短链dsRNA与dsRBM结合的茎结构两端都带有单链尾，单链尾的长度对于PKR的激活起到重要的作用，至少需要6个核苷酸才能激活，9个核苷酸是最适长度[5]。siRNA作为一类特殊的RNA在干扰素系统中被广泛研究，有研究显示PKR可以被合成的大小为21 bp的siRNA激活，进而参与干扰素系统的调控，这与认为小于33 bp的短链RNA无法激活PKR的观点相反，可能是由于合成的短链siRNA折叠方式不一样[5，7]。研究显示，转染抑制乙型肝炎病毒的siRNA并不影响PKR的活化情况，这说明siRNA对PKR的激活除了结构和长度的因素外，可能还存在其他因素使它不影响PKR的活化且能够发挥抑制病毒翻译的功能。

综上所述，对于调控PKR的RNA除了长短和结构之外，RNA的类型可能也是影响因素之一，其机制有待于进一步研究。

2.2 TLR(Toll-like receptor)配体 TLRs即 Toll样受体家族，包括TLR1～TLR11。TLRs在固有免疫中有重要的作用，可识别多种微生物的病原分子相关模式(PAMPs)，例如:TLR2识别革兰阳性菌的肽聚糖;TLR4可以识别革兰阴性菌的脂多糖(LPS);TLR3可以识别病毒的dsRNA等。TLR蛋白通过LRR(亮氨酸重复序列)与配体结合后激活下游信号分子JNK、P38、IRF-3等启动信号级联反应，发挥抗病毒作用。PKR可被LPS刺激的TLR4所活化，实验证实PKR敲除的小鼠细胞在LPS刺激后无法产生抗炎因子，提示PKR介导了TLR4诱导的信号通路[8]。最近发现，LPS刺激的内毒素耐受的巨噬细胞中PKR的磷酸化水平和PKR蛋白总量都下降，而用蛋白酶体抑制剂MG132能使这种现象得到回复。这说明耐受细胞中部分PKR会被蛋白酶体降解。进一步研究发现，PKR是同SOCS-1相互作用后被K48 Ub泛素化，进而通过蛋白酶体降解的[9]。TRAF家族作为TLR受体的下游分子，在免疫调节和激活NF-κB通路中发挥重要的作用。研究表明PKR C端(266aa～551aa)激酶区和TRAF5 C端(345aa～558aa)的TRAF domain存在相互作用，且只有PKR的二聚体活化形式才能聚集TRAF5并进一步激活 NF-κB 通路[10]。由此可见，PKR 与TLR在固有免疫应答中存在复杂的联系。

2.3 PACT(The protein activator of PKR)蛋白PACT是一种人源细胞蛋白，小鼠的同源蛋白称为RAX。当细胞处于应激状态时，PACT介导PKR的活化并不依赖 dsRNA[11]。在病毒感染的细胞中PACT将dsRNA募集至PKR，同时，具有在多种生长分化条件下调理细胞内PKR活性的潜力。PACT含有三个独立的区域，前两个同dsRBM类似，PACT domain 1和PACT domain 2能够促进PKR和PACT紧密结合。后一个PACT结构域(PACT domain 3)则是一个含66个氨基酸的区域，它与PKR结合不紧密但却是活化PKR所必需。PACT domain3与PKR激酶区的PBM基序结合使PKR从无活性结构中释放出来。通过定点突变研究，发现 PKR的aa328和aa335残基是PACT domain3结合的必需位点[2]。进一步研究发现，PKR上的 PBM328位和333位氨基酸是其与dsRBD结合的重要位点，若将这两个位点的天冬氨酸残基置换成甘氨酸，PKR在没有激活剂的情况下表现为持续性激活。且用一段结构类似PBM诱导肽，即与PKR 326-337aa相同基序的短肽，能通过竞争结合dsRBM2干扰dsRBM2与PBM的相互作用来活化PKR[2]。

2.4 细胞因子 研究证实PKR能够参与一些由细胞因子如 IFN、PDGF、TNF-α、IL等激活的信号通路。IFN是PKR经典的诱导剂;PDGF可诱使PKR活化，使早期即刻基因C-fos表达[11]。

3 PKR的功能

3.1 抑制病毒复制 最早发现的PKR功能是其具有抑制病毒复制的活性。病毒在细胞内复制过程中产生的dsRNA与PKR的N端dsRBM结合，并激活PKR，PKR C端激酶区与底物蛋白eIF-2 α相结合，使其51位的丝氨酸磷酸化。eIF-2 α为细胞内mRNA翻译起始的重要调节因子，eIF-2 α磷酸化可导致病毒或宿主mRNA进入核糖体形成起始复合物的过程受阻，从而抑制细胞和病毒的蛋白质合成[11]。研究发现病毒为逃逸PKR的抗病毒作用，例如:流感病毒主要通过两条途径来逃避PKR的抗病毒作用，一是病毒使胞内蛋白P58IPK聚合从而抑制PKR的激酶活性，另一条是通过病毒非结构蛋白NS1直接或间接作用阻止PKR的活化，用突变NS1的病毒株感染PKR敲除的小鼠和野生型小鼠，发现后者的病毒滴度明显低于前者，证明NS1能通过抑制PKR通路来帮助病毒复制[12，13]。

3.2 参与多条细胞信号转导通路的调节

3.2.1 STAT1(Signal transducer and activator of transcription)信号通路 STAT蛋白是胞内转录因子，其家族有众多成员，包括 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6等。STAT作为重要的转录因子，能介导多种生物功能。大部分细胞因子，如生长激素、IFN、G-CSF等可以通过作用于细胞内非受体型酪氨酸蛋白激酶JAKs，激活STAT从而调控基因的转录。

在鼠和人细胞中，STAT1、STAT3与PKR均有相互作用，在PKR Δ6(PKR主要活性区域都失活)突变细胞中，STAT1与DNA结合和转录激活受阻，证明PKR在STAT1的转录过程具有重要作用，且PKR与STAT1的作用是依赖于PKR RNA结合区的。PKR在介导 STAT3的磷酸化(Tyr705和Ser727)过程中扮演了非常重要的角色，进一步的研究表明，PKR同STAT3的作用是间接的，STAT3并不是PKR的直接底物[14]。

有文献显示，STAT是PKR抗病毒通路的一个重要分支，它作为下游分子参与了PKR的抗病毒作用[13]。

3.2.2 MAPK(Mitogen-activated protein kinases)信号通路 MAPK具有丝/苏氨酸催化活性，调节体内多种生物功能，MAPK分为ERK，P38，JNK等多个家族。PKR作为一种应激蛋白活化激酶，能够介导JNK和P38活化，在IFN-γ、IL-1等细胞因子作用下，P38和JNK活化是依赖PKR的。最近研究发现，在PKR沉默的细胞系中，病毒感染后MAPK的活化受到抑制，同样用dsRNA刺激这类细胞，MAPK活化也受到抑制，证明PKR对MAPK的活化起关键作用。突变PKR的激酶活性区，抑制了p38和JNK的活化，证明 p38和 JNK活化与PKR的激酶区有关[15]。有些研究发现PKR是MAPKs途径的上游调控分子，然而在UV诱导多种细胞(JB6C141细胞，GM09621XIBAO，MEFs)，发现ERK和ERK下游的RSK2可以引起PKR和eIF-2 α磷酸化从而介导细胞损伤甚至癌变[16]。

因此，MAPK和PKR之间的关系复杂多样，在细胞多个生物学活动中占有重要位置。

3.2.3 NF-κB信号通路 NF-κB是广泛存在于各类细胞中的一种转录因子，参与了各种细胞应急反应，如免疫应答、炎症反应和抗凋亡等基因的转录调控。NF-κB以同源二聚体或异源二聚体的形式存在，通常由I κ-B抑制其活性，NF-κB经典的激活途径是固有免疫所必需的。研究发现当大量表达PKR时，IKK活性增高，导致 IKK β蛋白磷酸化增多，解除了其对 NF-κB的抑制作用，NF-κB活化后进入胞核促进转录的发生[17]。而利用PKR敲除细胞实验表明，NF-κB的活化并不完全依赖于PKR，用dsRNA刺激仍然可以激活NF-κB，说明NF-κB可以被PKR依赖与非依赖的多种信号通路所激活[18]。PKR 底物 eIF-2 α在 NF-κB 诱导的凋亡反应中发挥着重要作用，突变eIF-2 α后NF-κB诱导的凋亡明显减少[19]，说明 eIF-2 α除了抑制翻译，也参与了其他细胞活动的调控，具体的分子机制需待进一步探究。

3.3 PKR与凋亡的关系 PKR的另一个重要功能是参与了对细胞凋亡的调控。在PKR敲除小鼠的MEF细胞中，dsRNA、TNF-α、LPS等诱导凋亡受到了显著的抑制。研究表明PKR敲除直接抑制了Fas mRNA的表达，从而抑制了Fas诱导的凋亡通路。PKR通过激活FAS通路，来激活下游的Caspase-8诱导凋亡的产生，FADD-/-的细胞可以抵抗dsRNA诱导的凋亡，而TNF-α诱导PKR敲除的细胞凋亡，发现 Caspase-8 mRNA 下调[20]。

研究发现在细胞凋亡的早期，PKR被水解、活化并伴随eIF-2 α磷酸化。在anti-Fas受体诱导的U937细胞凋亡过程中，PKR被水解成为N端38 kD和激酶端43 kD的两个片段;与此同时，eIF-2 α磷酸化增多，且从35 kD水解成32 kD。进一步研究证实caspase-3、caspase-7、caspase-8 能在 Asp125 处水解PKR，而 caspase-1和 caspase-11则无法水解PKR[21]。近年也有报道，PKR可以通过非Fas依赖途径诱导caspase-8的激活从而诱导凋亡。总之，PKR在凋亡途径中具有重要的调控作用，它可以多途径，多方式诱导凋亡的产生[22]。

4 PKR与其他RNA活性相关蛋白

除PKR外，与dsRNA相互作用的细胞蛋白还有Toll样受体家族(主要TLR3和TLR7)、RIG-I和MDA5[23]。RIG-I主要识别5'端三磷酸修饰的 RNA和非己的带有短链dsRNA结构或多聚尿苷修饰的RNA，还可识别正链和负链病毒RNA。MDA5则识别结合稳定的长链dsRNA结构，且特异性识别小核糖核酸病毒和病毒的模拟物PolyI:C。TLR3主要识别病毒dsRNA以及PolyI:C，TLR7则识别病毒的单链RNA。在PolyI:C刺激后，这些RNA结合蛋白可调控不同的信号转导通路，发挥不同的功能。TLR3主要是通过活化NF-κB通路发挥免疫调节作用，同时活化IRF3信号通路促使IFN的表达。RIG-I和MDA5主要通过 TBK-1活化 IRF3诱导IFN-β的产生，对于NF-κB通路的作用则非常微弱。有趣的是，PKR活性的抑制均可明显阻断IRF3和NF-κB信号通路[23]。

RIG-I、MDA5可诱导IFN的产生，在抗病毒效应中发挥了重要的作用。如在分别沉默RIG-I和MDA5的细胞中，轮状病毒感染后IFN下降不明显，而同时沉默 RIG-I和 MDA5后，轮状病毒诱导的IFN明显下降，PKR对轮状病毒诱导的IFN的作用可能主要发挥在IFN的分泌阶段，PKR促进IFN的分泌[24]。因此，这些RNA活化相关蛋白通过不同途径(主要是NF-κB和IRF3通路)，在不同的环节相互协同以发挥抗病毒作用。

5 PKR与疾病

随着医学日益发展，肿瘤已成为研究的焦点，凋亡则是抗肿瘤的一种重要途径。由于PKR和凋亡的关系密切，所以普遍认为PKR在肿瘤中也会起到一定的作用。目前，PKR在肿瘤细胞中的作用结果不一，一般认为PKR可以抑制肿瘤。抑制的机理可能是通过TNF-α启动caspase通路使肿瘤细胞发生凋亡;而在分化良好的肿瘤中，PKR的高表达可降低细胞增殖。有研究证明，p53能够诱导产生PKR，p53敲除的结肠癌细胞中PKR和其他一些目的基因的表达明显下降，且进一步研究发现p53直接作用于PKR的启动子，PKR在辅助p53抑制肿瘤生长中起了一定的作用，PKR敲除的结肠癌细胞变小且增殖速度加快，这与p53敲除的结肠癌细胞表现类似[25]。

另有一些研究不支持PKR在肿瘤中的抑制学说，相反，提出了PKR促肿瘤生长作用理论。一个实验证据是，PKR敲除的小鼠也并未为发现肿瘤发生率有所增加。另外，PKR在正常细胞(NHBES和HMECS)的表达水平明显低于癌细胞(A549，PC3)，在沉默PKR的A549和PC3癌细胞中，发现细胞凋亡明显增多[26]。PKR诱导凋亡与在癌细胞中的作用方式仍有待进一步的明确。

PKR在肿瘤预后判断方面也有一定的应用。临床资料表明，非小细胞肺癌患者中，癌细胞磷酸化型PKR和eIF-2 α较多者存活时间较长，可能作为对Ⅰ、Ⅱ级癌症患者预后评估的指标之一[27]。

除了肿瘤，PKR还与其它许多疾病的发生密切相关。在代谢性疾病糖尿病研究中，高脂饮食野生型小鼠易发展成为肥胖小鼠，出现高胰岛素血症，而PKR敲除的小鼠中血清瘦素水平低于野生型小鼠，不易发展为肥胖小鼠，提示PKR敲除小鼠对胰岛素敏感性增强，推测PKR直接靶向调节胰岛素受体，增强营养物和胰岛素的作用，为糖尿病治疗提供新的思路[28]。PKR 在神经疾病 Alzheimer's disease(AD)中，可以介导细胞凋亡。在AD患者的脑脊液中磷酸化PKR(pPKR)及其与PKR总量的比值均增高，且 pPKR的特异性高达 94.3%，灵敏度为91.1%[29]。这预示pPKR可能成为检测AD新的生物标志。

6 结语

PKR在抗病毒免疫中发挥了双重作用，一方面，PKR通过其dsRBD结合dsRNA后激活，调节固有免疫应答信号通路来影响固有免疫的强度;另一方面，PKR又可作为固有免疫应答的一个效应蛋白，直接干扰了病毒蛋白的翻译。因此，深入研究PKR与其调控病毒感染引起的免疫调控机制，以及阐明病毒是如何拮抗PKR效应的机理，无疑将对抗病毒感染疾病的预防和治疗提供新的策略。另外，PKR在其它疾病中的功能尚不明确，进一步研究PKR激活的意义和功能，可以为这些疾病的诊断和防治提供新的线索或治疗靶点。

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