电刺激对中枢神经系统损伤后轴突再生的作用

钟艺华 李光勤 唐显军 (重庆市肿瘤研究所普内科，重庆 400030)

中枢神经系统(CNS)损伤后的再生问题仍然是神经康复中所面临的难题。虽然在CNS损伤后，多重附加因素针对再生的阻碍作用和环境对于固有再生能力的对抗作用，导致轴突再生困难，但目前研究已肯定脑具有一定可塑性。临床研究发现电刺激对CNS损伤具有良好的促修复效果，为损伤后的轴突再生提供了新的治疗途径。本文将重点讨论CNS损伤后电刺激在促进轴突再生过程中所起的作用。

1 CNS损伤后轴突再生能力下降的原因

主要有两个方面:首先，在CNS损伤初期，由于中枢灰质的水肿和出血，以及供应相应区域的动脉血管痉挛，引起局部严重的缺血，导致在最初损伤的基础上由于各种炎症介质的释放造成二次损伤。这种损伤的发生是由于破坏了神经细胞内外的离子稳态(包括细胞内Ga2+和细胞外K+的平衡)，这种离子平衡的破坏与缺血、炎症、出血引起的生物化学反应是一致的，能诱导轴突顶梢的枯死和回缩，导致神经细胞结构完整性的破坏和严重的功能缺失，使得其本身缺乏再生能力〔1〕。

其次，CNS损伤后生存微环境的破坏，包括神经细胞释放的神经营养因子(NTF)〔如脑源性神经营养因子(BDNF)及神经营养因子(NT)-3等〕生成不足，以及各种内在的神经生长抑制因子〔如髓磷脂蛋白(NogoA)及少突胶质细胞糖蛋白(MOG)等〕的产生，阻碍少突胶质细胞的分化和髓鞘形成，影响神经元的存活，导致轴突再生受到抑制。

2 电刺激促进CNS损伤后轴突再生的依据

电刺激作为一种治疗手段已被广泛应用于CNS损伤和疾病的功能恢复中。自20世纪80年代，5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记被广泛应用于CNS神经干细胞研究中，人们发现在损伤或病理状态下，脑内的主要存在于侧脑室下区和海马齿状回颗粒下层的内源性神经干细胞(eNSC)能迅速地增殖和分化，具有替代损伤细胞的潜在能力，起到自发性修复的作用。另外，与脑内干细胞不同，无论是在正常还是损伤的脊髓中，神经干细胞只能分化为神经胶质细胞，而不能生成神经元。一系列研究证实:很多因素可以影响脊髓内神经干细胞的生成，其中脊髓本身的电活动性具有很重要的作用。Li等〔2〕在正常或损伤的实验动物中，将功能性电刺激(FES)植入大脑皮质或周围神经干进行电刺激，发现可以增加脊髓内eNSC的分化与增生，使脱髓鞘的轴突再髓鞘化，促进损伤的轴突再生，从而提高神经组织的修复能力，证实了成熟的CNS损伤后仍具有有限的再生能力。因为再生依赖于切断端轴突顶端的延伸能力，这种可再生长的轴突顶端被称为生长锥，具有感知环境及引导轴突生长方向的能力。成功的轴突再生首先需要损伤轴突的神经元必须是存活的，其次损伤的轴突必须能发芽并朝着目标区域生长，最后为了引导轴质的流动，轴突在目标区域内必须形成有功能的突触联系〔1〕。目前，诱导轴突生长已成为可能，这包括通过促进功能营养因子的释放和中和生长抑制因子的生成来操纵CNS再生的固有过程。较多研究〔3〕已经提示:在损伤的轴突周围，应用外源性的弱电场可能是由于对生长的轴突提供了亲神经的引导，所以能加速轴突再生。

3 电刺激促进轴突再生的细胞机制

神经细胞(包括神经元和胶质细胞)能对电刺激作出直接反应。通过对损伤轴突的电刺激发现电活动在星形胶质细胞的代谢调节中扮演着重要角色，该细胞能产生包括NTF在内的各种化学因子，以促进轴突再生，髓鞘及突触形成。例如:视神经Mueller胶质细胞，是一种特殊类型的视网膜星形胶质细胞，对电刺激的反应是通过上调NTF(如BDNF和IGF-1)进行表达的;而抗BDNF的选择性功能抑制性抗体能阻断由电刺激增强的轴突外生，说明电刺激可能通过NTF加速轴突外生。此外，实验证明视网膜神经节细胞(RGCs)-上丘核的电活动对于稳定突触和允许RGCs有效竞争来源于目标的生存信号是十分重要的;同时，神经元本身也能通过电活动增加NTF的产生，除了能增加包括BDNF和TrKB在下运动神经元的表达外，也可以提高神经元对这些营养因子的固有的敏感性。RGCs自身仅能很少对BDNF和其他肽类营养因子产生反应，而用电刺激却能很大程度的提高其对营养因子的反应性。相似的效应在海马神经元中也被发现，因为电刺激能引起TrKB在海马神经元中表达的增加;反过来，BDNF能提高海马神经元对电刺激的反应，支持在电刺激和营养因子之间存在协同的双向的交互作用。当轴索断裂后，神经元能通过上调再生相关基因增加胞体的反应，转录上调生长相关的蛋白(如 GAP-43，CAP-23和SCG10等)，这些蛋白在生长锥中作用于第二信使系统，通过影响细胞骨架结构的变化，调节神经递质的释放，从而促进轴突生长和调控新的突触连接〔4〕。对于细胞骨架结构的调节是通过上调细胞骨架蛋白(包括Tα-1-微管蛋白和肌动蛋白)来满足生长锥发展的需要，从而促进轴突再生〔5，6〕。

4 电刺激促进轴突再生的分子机制

在电刺激促进神经元存活和轴突再生的效应中，许多分子信号途径参与调节〔7〕。

(1)P13/AKT在电活动依赖的神经保护和再生中，这种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶途径通过激活许多缩氨酸营养因子调节其效应〔8〕。在体外，IGF-1能通过经由AKT激活的环磷酸腺苷反应元件蛋白(CREB)提高PC12神经元细胞系的存活，从而导致抗凋亡基因bcl-2的启动子的活动增加〔9〕。在鼠的视神经横断后电刺激角膜的模型中，IGF-1也能通过激活AKT信号调节电活动诱导的RGCs的神经保护和再生作用〔10〕。

(2)MEK/ERK在神经元中，活化的有丝分裂原蛋白激酶(MAPK)或MEK/ERK通路在去极化后能被激活。在海马神经元中，膜电位局部阈下值的改变也能激活MAPK信号通路〔11〕。在体外，MEK/ERK通路参与了RGCs对于NTF的生存应答，而抑制这条通路能阻断由电活动和BDNF引起的轴突存活和生长的效应。应用包括ERK激活在内的机制，去极化也能促进颗粒状小脑神经元的存活〔8〕。并且，MAPK/ERK通路通过调节CREB的磷酸化作用有助于活动依赖性基因的表达〔12〕。

(3)钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶(CaMKs)在通过增加细胞内Ca2+来调节信号通路激活的过程中起着十分重要的作用。CaMKsⅡ对于不同频率和持续时间的Ca2+振幅有不同的反应，能将局部增加的Ca2+转化为基因表达〔13〕，这可能是通过NFκB的激活和从胞质到胞核的运输起作用〔14〕;在树突中也能通过诱导没有新基因表达的要素约束蛋白(CPEB)来调节局部的蛋白合成，这种机制在突触可塑性和长期存活中起着作用〔15〕。另外，CaMKsⅣ在调整一些转录因子和通过活动依赖基因的表达调节神经元的可塑性方面都是必要的。并且，CaMKsⅡ为了整合突触后效应而特别集中在突触，说明CaMKs总是处于理想的位置对特别水平的电活动作出反应。

(4)NFκB通过调节活性依赖性神经营养因子(ADNF)和活性依赖性神经保护因子(ADNP)的效应而参与到活动依赖性的神经保护中。这些多肽类首先作为血管活性肠肽(VIP)神经保护效应的介质而被发现;并在脊髓培养中，通过对电活动的反应和调节其神经保护效应而被分泌。这些来源于ADNF(ADNF-9)和ADNP的多肽类在缺乏生长因子介质的RGCs人工培养中，能显著地增加轴突的存活和生长〔16〕。最近，ADNP被证明对于体内的RGCs而言，在视网膜局部缺血和视神经粉碎的动物模型中起到了重要的保护和再生作用〔17〕。

(5)cAMP在RGCs中，通过提高cAMP能模仿由于去极化引起的NTF对轴突存活或生长的增强效应，而阻断cAMP的提高或抑制下游的蛋白激酶A(PKA)能废除这种电活动效应。因此，cAMP对于电活动诱导的RGCs的轴突存活和生长而言将是一种重要的介质。cAMP能补充细胞表面的NTF受体，并在长时间内增加受体的基因表达;也能激活鸟嘌呤核苷酸交换因子，具有促进神经元的增殖，分化和轴突生长的作用;在去极化的细胞中能激活钙依赖的Ga2+释放，并提高突触神经递质的释放，从而加强电活动;还能激活磷酯酶C和D，及其后的PKC，导致在背根神经节(DRG)神经元中活动的敏化作用;并且，在RGCs中也能调节N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体的反应。这样，有许多通路通过cAMP调节电刺激与神经元存活和轴突生长之间的关系。在运动神经元中，假定存在基础水平的cAMP，注射rolipram(神经磷酸二酯酶Ⅳ的特殊抑制剂)将通过增加运动神经元的数量加速轴突外生，这种效应与电刺激相似〔18〕。毛喉素能通过刺激腺苷环化酶增加内源性cAMP。联丁酰基cAMP(dbcAMP)，一种可溶性cAMP类似物，能通过增加运动神经元的数量扩大神经突及其长度〔19〕。SQ22356，一种强效的可溶性腺苷环化酶抑制剂，能降低内源性cAMP，在神经元中引起剂量依赖性衰减而扩大神经突及其长度。研究人员通过实验发现在人工培养的运动神经元中，毛喉素和dbcAMP是通过使PKA RIIB亚组磷酸化来相应地增加神经元的神经突数量及其长度的，而由cAMP升高引起的PKA磷酸化作用和增加神经突长度的效应能通过cAMP/PKA抑制剂-H89减弱，从而说明cAMP对电刺激的反应是通过PKA加速轴突外生而起作用。然而，不像DRG感觉神经元的cAMP在试管内激活细胞外信号调节激酶(ERK)下游的PKA，作为对毛喉素和dbcAMP的反应，提高运动神经元的cAMP并没有在基础水平上使ERK2磷酸化，或是增加pERK/总ERK的比例;即使通过SQ22356和H89减少cAMP，也并不能改变ERK2的磷酸化作用，这与在运动神经元中基础水平的ERK2不依赖cAMP激活相一致。因此，在cAMP促进运动轴突生长的效应中，ERK活化作用并不是必要的。综上所述，电刺激能提高cAMP，经PKA上调BDNF和TrKB，并依次上调再生相关基因进而促进轴突外生。然而，不像感觉神经元，cAMP在运动神经元中影响神经突外生并没有通过ERK通路的调节〔18〕。

5 电刺激模式的选择与轴突再生的关系

通过电刺激诱导基因表达的差异依赖于其特定模式的应用，包括刺激频率、持续时间和波形的参数调节。在色素性视网膜炎(RP)病人中，两相的脉冲相对于单相的刺激能更好地持续地诱导光幻视;间歇性的脉冲较连续性的具有更强的神经保护作用。例如:电刺激模式能决定视网膜Mueller细胞中IGF-1的上调;K+去极化依赖于L-型Ca2+通道和MAPK信号通路;复制的电刺激依赖于N-型Ca2+通道和PKA，PKC信号通路;用4 Hz的电刺激小脑中的并行纤维能引起长期增益效应(LTP)，这种作用是通过突触前的cAMP机制调节;而用1 Hz的电刺激相同的纤维能引起突触后的LTP，但所需要的是NO而不是cAMP〔20〕;电刺激脊髓灰质后角神经元的传入纤维C能导致频率依赖的ERK的磷酸化作用，更高频率(10 Hz)的电刺激通过NMDA能诱导更多的pERK通道信号;反之，更低频率诱导更少的信号，说明刺激频率在激活的分子途径中是十分关键的。在CaMKsⅡ途径中，Ca2+的短暂增加较持续提高能产生更强的目标活化作用，证明Ca2+的简谐运动在轴突的诱导生长中扮演着重要的角色;而且，生长锥能对Ca2+瞬态的特别频率作出反应，包括在中频(1 Hz附近)时轴突生长和在更低或更高的频率时生长锥停止生长或回缩。此外，对于每种神经元类型决定最佳的刺激参数也是必需的。比如在视网膜对外源性电刺激的反应中，对于特定的脉冲持续时间，不同的细胞层具有倾向性的反应;而且，随着脉冲持续时间的增加，刺激的阈值在下降。但对于RGCs和其他神经元的神经保护和再生的最佳刺激参数还没有最终决定。

6 总结和展望

综上所述，电刺激促进CNS损伤后的轴突再生的作用机制主要表现在以下两个方面:①可引起局部NTF的释放，产生保护中枢神经细胞的效应。②产生上行传导的神经信号，使中枢胞体产生动作电位，在轴突再生，少突胶质细胞分化和髓鞘形成，神经元存活等方面发挥促进作用。目前FES在临床上取得良好的治疗效果，但由于需要外科手术植入，操作复杂，存在一定的风险性和治疗费用高等缺点，所以很多专家希望能利用电针针刺治疗克服FES的不足。电针针刺治疗作为电刺激的另一种治疗方式，将为CNS损伤后促进轴突再生提供新的研究思路和手段〔2〕。

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