免疫印迹法检测胰岛自身抗体系列在糖尿病分型诊断中的应用

邱 阳 郭慧淑 刘越坚 单路娟 郭 莉 (大连医科大学附属第一医院中心实验室，辽宁 大连 116011)

糖尿病的早期诊断和分型在其治疗和预后中显示出十分重要的作用。1型糖尿病(T1DM)是由于自身免疫损伤胰岛β细胞，从而使胰岛素敏感性降低或分泌减少的疾病。患者体内存在多种针对胰岛β细胞的自身抗体，其中血清谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、抗胰岛β细胞抗体(ICA)、抗胰岛素自身抗体(IAA)是极为重要的三种指标〔1〕，其地位和作用已得到认可。本文应用免疫印迹法(IB)联合检测上述三种抗体，分析并探讨其对糖尿病分型诊断的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 实验组为2008年3月至2012年12月来本院内分泌科就诊的门诊及住院患者187例，其中T1DM 69例，男39例，女30例，年龄11～40〔平均 (23±12)〕岁;2型糖尿病 (T2DM)118例，男62例，女56例，年龄33～72〔平均 (52±18)〕岁，半年内未用胰岛素。所有病例均经临床及实验室检查后按1999年WHO糖尿病诊断标准确诊，并排除继发性和妊娠糖尿病。健康对照组为2011年9月来本院体检的健康者30例，其中男13例，女17例;年龄25～57〔平均 (41±14)〕岁，空腹血糖均在正常范围内，且无糖尿病家族史和自身免疫病史。

1.2 方法

1.2.1 采血 清晨空腹采静脉血，37℃放置 30 min，3 000 r/min离心10 min，分离血清，－20℃保存备用。

1.2.2 抗体测定 采用免疫印迹法测定GADA、ICA、IAA，试剂盒购于深圳伯劳特生物制品有限公司。操作过程:(1)取出试剂盒，室温平衡。在含有印迹膜条的反应槽中加入1 ml工作液，水平振荡5 min后加入待检血清 10 μl，再次水平振荡30 min。(2)弃去槽中液体，每槽中加入1 ml洗涤应用液洗涤5 min，弃去液体。重复洗涤三次。(3)每槽中加入1 ml工作液及20 μl酶联试剂，水平振荡器上振荡0.5 h。(4)洗涤同步骤(2)。(5)每槽中加入显色剂1 ml，水平振荡器上振荡10 min。(6)显色清楚后，弃去显色剂液，用自来水反复冲洗。(7)取出印迹膜条，晾干后与标准带对照判定结果。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0软件行χ2检验。

2 结果

免疫印迹法检测69例TIDM型糖尿病患者，其中GADA阳性45例(65.22%)，ICA阳性37例(53.62%)，IAA阳性20例(28.99%)。在118例T2DM型糖尿病患者中，GADA阳性15例(12.71%)，ICA阳性 13例(11.02%)，IAA阳性 7例(5.93%)。在30例健康体检者中，只有ICA阳性1例，其余均为阴性。由此可见，T1DM组胰岛自身抗体的阳性检出率明显高于T2DM组及正常对照组(P＜0.05)。在T1DM组中，3种抗体检出的阳性率依次为GADA＞ICA＞IAA，同时3种抗体联合检测的阳性率也明显高于单项检测(P＜0.05)。

3 讨论

糖尿病是一种代谢综合征，在临床上常见且多发。糖尿病分型方法虽经多次修订〔2～4〕，但仍然不尽如人意。最常用的是按照世界卫生组织及国际糖尿病联盟专家组的建议，将糖尿病按病因分型分为1型、2型、其他特殊类型及妊娠糖尿病4种〔5〕。以往主要依据患者临床表现和血清胰岛素水平，这种分型方法对成人隐匿性免疫糖尿病(LADA)不易察觉，具有一定的局限性。近年来随着糖尿病免疫标志物的出现，临床分型有依赖于血清免疫标志物检测的趋势。目前用于糖尿病诊断的血清免疫标志物主要有 GADA、ICA、IAA〔6〕。

T1DM患者在无症状以及发病后一段时期内可检出多种针对胰岛β细胞的自身抗体，如GADA、ICA、IAA、酪氨酸磷酸酶抗体(IA)等，每一种抗体和T1DM的发生、发展都密切相关。GADA是合成γ氨基丁酸(GABA)的限速酶，在胰岛β细胞中与胰岛素同时存在，在患者出现T1DM临床表现前数年甚至10余年即可出现，与β细胞慢性损伤的相关性好、持续时间长、阳性率高〔7〕。作为LADA预测的早期诊断指标，ICA是针对胰岛细胞内具有的胞质成分多种抗原的混合抗体，当这种抗体和胰岛细胞的表面抗原结合后可引起免疫反应，激活补体系统，最终引起细胞的溶解和死亡而导致糖尿病;新发的T1DM中阳性率为65%～85%，随着病程延长，阳性率逐渐降低。因此对少年起病的T1DM早期有较高的诊断价值〔8〕。IAA是针对内源性胰岛素的抗体，也是唯一针对胰岛β细胞的一类特异性抗体。在糖尿病自身抗体中，IAA出现最早，持续时间较短〔9〕。有国外文献报道，经典T1DM患者IAA阳性率可达70%〔10〕，对T1DM诊断有较好的敏感性。IAA绝大部分与胰岛素结合成复合物而使其失去生物活性，因此IAA的测定能为治疗糖尿病提供重要依据，也是评价药用胰岛素的理想指标。

目前主要是采用放射免疫法、放射配体法、酶联免疫法等检测糖尿病分型的抗体。本组研究采用的免疫印迹技术是将凝胶电泳(SDS-PAGE)的高分辨率和免疫学反应的高特异性有效结合的一种新的分子生物学免疫技术。此方法首先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将生物活性物质高效分离，然后通过电转移将其转印在硝酸纤维膜 (NC膜)上，与待检血清反应，若血清中含有相应抗体，则抗原抗体结合，再分别加入酶联二抗和显色剂，相应抗原位置即出现显色区带，与标准区带比较，判定结果。该方法即保持了高分辨率又不失去原有抗原性，以便进行各种生物控制、免疫识别、扫描和保存。具有不同分子量的抗原包被于同一印记条，可以同时联合检测ICA、GADA、IAA 3种自身抗体，提高检出率〔11〕，而且无需特殊设备，操作简单方便，时间短，重复性好，是糖尿病自身抗体检测的一种简便有效的方法。本研究显示，免疫印迹法检测T1DM组GADA、ICA、IAA阳性率明显高于T2DM组和对照组，说明三种抗体是鉴别T1DM和T2DM及预测和早期诊断T1DM的重要指标。

1 郭 莉，单路娟，邱 阳，等.糖尿病患者血清GAD-Ab、ICA、IAA联合检测的临床意义〔J〕.大连医科大学学报，2004;26(2):136-8.

2 Dellinger RP，Carlet JM，Masur H，et al.Surviving sepsis campaign guidelines for management of severe sepsis and septic shock〔J〕.Crit Care Med，2004;32(3):858-73.

3 Annane D，Maxime V，Ibrahim F，et al.Diagnosis of adrenal insufficiency in severe sepsis and septic shock〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2006;174(12):1319-26.

4 Cooper MS，Stewart PM.Corticosteroid insufficiency in acutely ill patients〔J〕.N Engl J Med，2003;348(8):727-34.

5 《中国糖尿病防治指南》编写组.中国糖尿病防治指南〔M〕.北京:北京大学医学出版社，2004:223.

6 张士荣，崔 琢，周 静.GAD-Ab、ICA检测在糖尿病分型诊断中的临床价值〔J〕.中华全科医学，2008;6(12):1299-300.

7 朱禧星.现代糖尿病学〔M〕.上海:上海医科大学出版社，2000:1-95.

8 赵成玉，高继东.谷氨酰脱羧酶抗体和胰岛细胞抗体测定的临床意义〔J〕. 青海医药杂志，2005;35(5):62-4.

9 Barker JM，Barriga KJ，Yu L，et al.Prediction of autoantibody positivity and progression to type 1 diabetes:diabetes autoimmunity study in the young(DAISY)〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2004;89(8):3896-902.

10 Williams AJ，Norcross AJ，Dix RJ，et al.The prevalence of insulin autoantibodies at the onset of type 1 diabetes is higher in males than females during adolescence〔J〕.Diabetologia，2003;46(10):1354-6.

11 Wenzlau JM，Juhl K，Yu L，et al.The cation efflux transporter ZnT8(Slc30A8)is a major autoantigen in human type 1 diabetes〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2007;104(43):17040-5.