流式细胞术检测口腔鳞癌CD105与VEGF－C、nm23表达的关系

曹 岩 申叶春 张 凡 常永霞 张 斌 (张家口市第一医院口腔科，河北 张家口 075000)

实体肿瘤的浸润生长和转移均需要血管生成，肿瘤新生血管密度是评估患者转移及预后的重要指标，而新生血管内皮主要的标记物为CD105。血管内皮生长因子-C(VEGF-C)是目前所知作用最强的血管生长因子，在肿瘤血管形成过程中起重要作用，并与肿瘤淋巴结转移密切相关;转移抑制基因nm23是一种肿瘤转移抑制基因，肿瘤组织该基因的表达降低是实体瘤浸润生长和转移的必要条件。VEGF-C和nm23在口腔鳞癌中的表达与微血管密度(MVD)及其口腔鳞癌转移的关系目前尚不明确。本文探讨口腔鳞癌VEGF-C、nm23和内皮细胞CD105表达，与局部血管生成及肿瘤侵袭转移的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集河北北方学院附属第一医院1992～2006年行手术切除治疗的口腔鳞癌患者的存档蜡块68例，标本均经病理证实。所有患者术前均未接受放化疗及免疫治疗，均有完整的临床病理资料。年龄23～74(平均41.35)岁。有颌下淋巴结转移者28例，无淋巴结转移40例。另选择正常口腔黏膜标本16例作为对照。

1.2 试剂与方法 试剂:兔抗人VEGF-C多克隆抗体、鼠抗人nm23单克隆抗体和鼠抗人CD105单克隆抗体(均为工作液)SP免疫组化超敏染色试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。3氨基-9-乙基-卡唑(AEC)染色剂购自福州迈新生物技术有限公司。采用免疫组织化学SP法，实验操作按试剂盒说明。VEGF-C和nm23用DAB显色，用试剂公司提供的阳性片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替第一抗体作为阴性对照。CD105单克隆FITC标记抗体采用美国B-D公司产品。流式细胞术主要步骤:新鲜标本用眼科剪刀粉碎后PBS漂洗，800 r/min离心3 min，2次，70%冷乙醇固定，4℃冰箱过夜，300目尼龙筛网过滤，再用PBS调整细胞浓度至1×106/ml。PBS洗去乙醇，加入FITC标记的荧光抗体，4℃避光孵育30 min，PBS漂洗利用美国B-D公司生产的Facscalibur型流式细胞仪，以波长635 nm、输出功率为15 W的氩离子激光器作光源检测分析10 000个细胞。

1.3 结果判定 VEGF-C和nm23均主要为胞质着色，少数为胞核着色，以胞质/胞核内出现棕黄色颗粒的细胞为阳性染色细胞，判定标准为:以阳性细胞率＞25%为阳性表达(+)，阳性细胞率≤25%为阴性表达(－)。CD105阳性率:阳性细胞大于50%为阳性，小于20%为阴性，20% ～50%之间为可疑阳性。

1.4 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件进行χ2、t检验和等级相关分析。

2 结果

2.1 VEGF-C和nm23在口腔鳞癌和正常上皮中的表达VEGF-C、nm23在口腔鳞癌组织中的阳性表达率分别为52.94%和48.52%，前者明显高于正常组织(30.27%)(P＜0.01)，而后者低于正常组织(66.95%)(P＜0.05)。

2.2 VEGF-C和nm23表达与口腔鳞癌淋巴结转移的关系淋巴结转移的口腔鳞癌组织中VEGF-C阳性表达率(79.82%)显著高于无转移的组织(25.69%)(P＜0.01)，而在有淋巴结转移的癌组织中nm23的表达(35.88%)明显低于无转移的组织(61.03%)(P＜0.05)。

2.3 CD105阳性率 CD105在正常上皮中呈现阴性表达，而在口腔鳞癌中呈现阳性表达(84.17%)，且肿瘤中央阳性率明显高于肿瘤周边(P＜0.01)。

2.4 VEGF-C和nm23表达与CD105阳性率的关系 VEGF-C阳性表达的口腔鳞癌CD105阳性率(91.22%)明显高于其阴性表达组(77.29%)(P＜0.05)，且两者之间存在密切相关(r=0.863 7，P＜0.01)，nm23阳、阴性表达的口腔鳞癌中CD105阳性率分别为74.17%和86.08%。差异无统计学意义(P＞0.05)，两者之间不存在直线相关(r=－0.157 7，P＞0.05)。

2.5 VEGF-C和nm23表达的相关性分析 相关分析结果显示，VEGF-C表达与 nm23表达呈负相关(r=－0.525，P＜0.01)，即VEGF-C阳性表达率较高者nm23阳性表达率较低，VEGF-C阳性表达率较低者nm23阳性表达率则较高。

3 讨论

肿瘤的浸润发展与转移是恶性肿瘤的临床生物学特性之一，直接导致口腔鳞癌临床分期滞后，甚至丧失手术机会，是影响口腔鳞癌预后的主要因素之一。近年来研究表明，肿瘤诱导的血管生成反应与肿瘤的生长、浸润及转移密切相关。

VEGF-C为目前已知的作用最强的促血管生成因子，在肿瘤血管形成中起重要作用。VEGF-C是VEGF家族的新成员，它是一种针对淋巴管内皮细胞的有丝分裂原，双重转基因小鼠实验证明，VEGF-C能诱导淋巴管生成，并介导肿瘤细胞播散和区域淋巴结转移〔1～3〕。VEGF-C和受体VEGF-R3结合后，通过MEK/ERK和PI3激酶/Akt途径引起淋巴管内皮增生，并可能改变原有的和新生的淋巴管内皮的通透性以及肿瘤细胞和胞外基质的黏附性;同时淋巴管数目增多，使瘤细胞接触淋巴管的机会增多，也促进肿瘤的转移。近年来发现VEGF-C及VEGF-R3与头颈部肿瘤、胃癌、大肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤的淋巴管侵犯及淋巴结转移有关，并且是独立的预后不良因素。本研究结果提示VEGF-C可能参与口腔鳞癌的发生过程。VEGF-C阳性表达率较高的口腔鳞癌组织有较强的侵袭和穿越淋巴管的能力，其阳性表达可能与口腔鳞癌淋巴结转移和进展有关。

CD105基因位于人染色体9q34，其蛋白是一种同型二聚体的膜结合糖蛋白，分子量为180 kD，是转化生长因子受体复合物的成分之一，其功能是参与血管生成。CD105是一种内皮细胞标志物，仅在处于增殖状态的肿瘤组织血管内皮细胞上而在正常的组织血管上无表达〔4～6〕。本实验提示VEGF-C在促进口腔鳞癌微血管形成中起一定作用;同时，肿瘤中央部位微血管密度较高，而中央部位由于缺氧导致的坏死也比较严重，可能是刺激VEGF-C合成的主要因素，当肿瘤生长到一定体积时，因宿主血管生成不足，而引起局部缺氧，从而刺激肿瘤细胞分泌VEGF-C，促进新生血管生成，增加血管通透性。因此，VEGF-C一方面加速了肿瘤的生长，另一方面促进了肿瘤的转移。

已知人类的nm23基因家族有8个成员，nm23基因编码产物是核苷二磷酸激酶，它通过调节GTP的合成参与G蛋白调控的跨膜信息传递，从而对细胞的分化及癌基因的转化起作用，此外研究显示尚有激发管蛋白聚合的作用，因此具有抑制肿瘤转移的能力，与抑制肿瘤转移相关的是 nm23-H1〔7～9〕。nm23-H1编码一个相对分子质量为18×103的二磷酸核苷激酶，与肿瘤的远程转移有关，其抑制肿瘤转移的作用机制仍不清楚。nm23基因与口腔鳞癌的关系，目前这方面的研究较少，且得出的结果有很大的不一致性，有报道〔8〕认为nm23基因只与宫颈腺癌的预后有关而与宫颈鳞癌无关。有学者〔9〕对乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌的研究中发现，肿瘤组织中nm23表达与淋巴结转移或远处转移呈负相关，说明nm23基因在肿瘤的浸润及转移过程中起重要的抑制作用。本研究提示nm23基因的失活与肿瘤的发展密切相关。nm23基因突变、低表达具有促进肿瘤发展、浸润和转移的作用。nm23基因的表达对微血管生成及肿瘤淋巴结转移可能具有协同作用。本研究提示nm23低表达可能促进VEGF-C高表达，从而促使癌间质血管新生，为肿瘤的浸润进展提供氧和营养物质;在口腔鳞癌细胞分化、转移和临床进展过程中，VEGF-C与nm23之间可能具有相互诱导或信息传递的负调节作用。

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