淤胆大鼠肝内胆管上皮细胞原纤毛形态观察

杨 静，杨秀竹，刘洪斌

天津市南开医院中西医结合急腹症研究所(天津 300100）

胆汁由肝细胞分泌，胆管上皮细胞对胆汁的形成有调节作用。原纤毛是胆管上皮细胞的一个细胞器，近年来研究始发现胆管上皮细胞原纤毛可以发挥感受器的作用，影响胆汁的分泌[1]。现代研究逐渐认识到，在某些肝脏疾病中，胆管上皮细胞发挥了重要的作用[2]。保护胆管上皮细胞及其功能是一个重要的治疗靶点。我们利用胆管结扎方法制备了肝外淤胆大鼠模型，并观察了淤胆时胆管上皮细胞原纤毛形态上的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性Wistar大鼠15只，由天津市实验动物科技有限公司中心提供，合格证号SCXK（津）2009-0001，体质量（250±30）g。随机平均分为3 组：正常对照组（ratsctr）、胆管结扎7 d 组（ratsL7）、胆管结扎10 d组（ratsL10）。

1.2 主要实验仪器 动物手术显微镜，电子天平（SARTORINS，德国），手术器械。

1.3 相关试剂 多聚甲醛，戊二醛，平衡盐溶液，生理盐水，美蓝。

1.4 模型制备与样品处理方法 参照文献报道[3]采用胆管结扎制备胆汁淤积模型。三组大鼠全身肝素化后用生理盐水清除肝脏内血液；之后行胆总管插管，灌注固定液，约10 min后至肝脏变为灰白色，离断肝脏，2%戊二醛固定，送检电镜。

1.6 检测指标 南开大学电镜中心行扫描电镜分别观察大胆管（直径＞100 μm）和小胆管（直径＜50 μm）的胆管上皮细胞原纤毛形态特点。

2 结果

2.1 纤毛长度的变化 正常大鼠肝内胆管上皮细胞原纤毛的长度因胆管直径不同而有所差异。大胆管原纤毛的长度为（7.76±1.14）μm。淤胆后，ratsL7组原纤毛长度变得不规则，90%以上明显变短，小于10%的原纤毛长度仍> 6 μm，平均长度为（2.92±1.39）μ m；ratsL10组，原纤毛长度变短至（2.34±0.37）μm。小胆管有明显的微绒毛结构，其原纤毛长度约（5.15±0.89）μm。正常大鼠胆管上皮细胞原纤毛平整伸展入胆管腔内。淤胆后，ratsL7组原纤毛顶端普遍发生卷曲，未卷曲主干部分长度为（2.52±0.96）μm。ratsL10组，卷曲的原纤毛数量明显减少，长度缩短至（2.31±0.53）μm。（结果见图1，表1）

2.2 纤毛数量的变化 经扫描电镜10 000倍放大，大胆管ratsctr组每个视野中原纤毛的数量为（12±3）根。在选取的观察点，原纤毛的数量随时间延长而显著的增加：ratsL7组为每视野（87±12）根，ratsL10组为每视野（197±46）根，差异有统计学意义。小胆管原纤毛数量的变化与大胆管相似：与ratsctr组相比，ratsL7组有所增加，每视野由（4±1）根增至（16±2）根，差异有统计学意义。ratsL10组原纤毛数量与ratsctr组相比也有显著增加，每视野由（4±1）根增至（15±3）根，但与ratsL7组相比无明显差异。（结果见图2，表2）

图1 胆汁淤积前、后胆管上皮细胞原纤毛形态的变化（扫描电镜）

表1 胆汁淤积对原纤毛长度的影响

表2 胆汁淤积对原纤毛数目的影响

3 讨论

胆管上皮细胞在肝脏的多种疾病中发挥着重要的病理作用。胆管上皮细胞（biliary epithelial cell，BEC）约占肝脏细胞总数的3%～5%，它们衬覆着肝内的一个复杂的、相互联系的网状导管结构，包括毛细胆管、小叶间胆管、左右肝管，称为肝内胆管系统（IHBDS）。同时，胆管上皮细胞也衬覆着肝外胆管。BEC 在水、电解质运输过程中发挥的作用已得到证实。原纤毛作为胆管上皮细胞的一个重要的细胞器，理应引起足够的重视。研究证实纤毛形态的不同伴随着功能的不同[4-6]。

结扎胆总管是制作梗阻性胆汁淤积模型的常用方法。而胆管增生（胆小管反应）被认为在胆源性肝纤维化的启动和发展中发挥至关重要的作用[7]。通过实验我们发现结扎胆总管致肝外淤胆时大胆管与小胆管上皮细胞原纤毛的形态与正常大鼠相比有所不同：

首先是纤毛长度的变化。据文献报道[1]，正常大鼠大胆管上皮细胞原纤毛的长度要长于小胆管上皮细胞原纤毛，本实验也证实了这一点。淤胆7 d，绝大多数（90%以上）的大胆管上皮细胞原纤毛长度显著缩短，小于10%的原纤毛仍保持原长度；至淤胆10 d，全部的大胆管上皮细胞原纤毛均缩短至2～3 μm。小胆管上皮细胞原纤毛的变化与之不同，淤胆7 d 时，原纤毛顶端发生了卷曲；淤胆10 d，卷曲的原纤毛数量明显减少，长度与ratsL7组未卷曲的主干部位一致。可推测，淤胆时，小胆管上皮细胞感受着物理（压力）渗透压、化学及生物性的不同刺激，原纤毛可能发生了断裂，导致其长度变短，大胆管上皮细胞原纤毛未见此变化，可能与时间点的选择有一定关系。

其次是纤毛数量的变化。胆汁淤积7 d 后，大胆管上皮细胞原纤毛数量明显增加。淤胆10 d，原纤毛数量的增加更加明显。小胆管上皮细胞原纤毛增加的程度稍弱，推测某种程度上与胆总管梗阻模型的病理进程有关。结扎胆总管远端后，胆汁淤积在胆总管和肝脏内，造成肝外胆总管近端极度膨大，肝内胆管靠近肝门处的一级分支增粗了十数倍，这一趋势随淤胆时间延长而愈加明显。而在肝脏内部，因为有肝脏细胞与组织的支撑，肝内胆管的后级分支感受到的压力要逐级递减。所以胆汁淤积程度不同，给予各级胆管的刺激也不同，这可能是原因之一。

综上所述，淤胆后，胆管上皮细胞原纤毛具有特殊形态的原因可能是：在不同直径的胆管中，纤毛发挥着不同的作用；此外还可能与结扎胆总管所造成的肝外淤胆的病理进程有关，即在我们选择的观察时间点，大、小胆管受累的程度不同，因而其变化可能具有时效性。若缩短观察的间隔时间，大、小胆管上皮细胞原纤毛是否会发生同样的变化，原纤毛在感受胆汁淤积所造成的压力和化学变化中又具体发挥了怎样的作用，这将会是一个值得深入研究的课题。

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[4]Masyuk AI, Huang BQ, Ward CJ, et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through in⁃teraction with primary cilia [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol , 2010, 299(4): 990-999.

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