K－Ras与B－Raf在前列腺癌组织表达及其与预后的关系

王朝晖，李玉中，宋丽媛

（大连医科大学附属第二医院1.实验中心；2.检验科；3.病理科，辽宁 大连116027）

随着人口老龄化程度的加剧及人们生活条件的改善，前列腺癌的发病率逐年增长，跃居男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤的第三位。近年来分子靶向药物酪氨酸激酶受体抑制剂TKI（tyrosine kinase inhibitor）在临床上已广泛应用。该药的作用机制通过抑制EGFR（epidermal growth factor receptor）酪氨酸磷酸化，阻止 EGFR－Ras－Raf－MEK－ERK 信号转导通路的启动，抑制肿瘤细胞生长。研究K－Ras和BRaf在前列腺癌组织的表达，旨在探讨其与前列腺癌发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集大连医科大学附属第二临床学院2010年1－12月手术切除的前列腺癌病理组织蜡块74例，74例癌症患者中年龄34－92岁，平均年龄（58.00±13.51）岁。标本按2002年 WHO肿瘤国际组织学分类标准分类：其中高中分化癌23例，低分化癌51例；按Whitmore－Jewett（ABCD）系统标准进行临床分期：其中（A＋B）期40例，为未浸润转移组；（C＋D）期34例，为浸润转移组。前列腺增生39例，患者年龄40－87岁，平均年龄（62.34±14.37）岁。所有患者术前均未进行放、化疗和生物治疗。

1.2 方法

用免疫组织化学链霉菌抗生物素过氧化物酶（SP）法检测K－Ras和B－Raf蛋白在前列腺癌和增生组织中的表达。K－Ras和B－Raf单克隆抗体分别购自Ab－cam和Santa Cruz，使用浓度分别为1∶200和1∶400。SP试剂盒和二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购自北京中山生物技术有限公司。操作步骤按免疫组化试剂盒要求进行，组织切片在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中用微波抗原热修复100℃10分钟，用磷酸盐缓冲液代替一抗做空白对照。

1.3 结果判断

K－Ras和B－Raf在肿瘤细胞胞质中出现棕黄色为阳性细胞，无阳性细胞（－）；阳性细胞＜25%（＋）；25%≥阳性细胞＜50%（＋＋）；阳性细胞≥50%（＋＋＋）。（＋）以上为阳性表达。

1.4 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件，两组或多组计数资料采用χ2检验进行数据统计学分析。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 K－Ras在前列腺癌组织的表达

K－Ras在前列腺癌组织的表达（79.73%，49／74）明显高于前列腺增生（23.08%，9／39），χ2＝19.025，P＜0.01。在高中分化和低分化的表达分别为 （65.22%，15／23）和 （66.67%，34／51），χ2＝0.15，P＞0.05；在未浸润转移（A＋B）期和浸润转移（C＋D）期 表 达 分 别 为 （60.00%，24／40）和（73.53%，25／34），χ2＝1.504，P＞0.05。

2.2 B－Raf在前列腺癌组织的表达

B－Raf在前列腺癌组织的表达（64.86%，48／74）明显高于前列腺增生（10.26%，4／39），χ2＝30.659，P＜0.01。在高中分化与低分化表达分别为（43.48%，10／23）与 （74.51%，38／51），χ2＝6.698，P＜0.05，在（A＋B）期与（C＋D）期表达分别为 （42.50%，17／40）与 （91.18%，31／34），χ2＝19.107，P＜0.05。

2.3 K－Ras和B－Raf蛋白表达的相关性

K－Ras和 B－Raf蛋 白 表 达 呈 正 相 关，r2＝0.272，P＝0.019，P＜0.05。

3 讨论

Ras／Raf／MAPK （mitogen－activated protein kinase）信号通路是细胞生物学中最具特征的通路，是膜受体信号向细胞内传递的重要途径，该通路参与调节细胞生长、凋亡和重要基因的表达［1］。Ras是一种鸟核苷酸结合蛋白，具有内源性GTP酶活性，它包括K－Ras、N－Ras、H－Ras等，Ras编码小GTP结合蛋白，参与很多细胞功能如细胞分化及蛋白运输等。Ras／Raf／MAPK信号通路中的膜受体被一些生长因子激活后，进而激活Ras蛋白，活化的Ras－GTP直接与下游Raf的N端结构域结合并使其激活，活化的Raf又激活下游的MAPK，从而激活了MAPK级联反应。Raf作为Ras下游的关键性蛋白之一，是丝氨酸／苏氨酸激酶家族成员，亚型包括Raf、A－Raf和B－Raf。MAPK激活后可以激活多种核转录因子和激酶，进而影响基因转录和调节细胞功能，且当活力失控时会导致肿瘤［2，3］。

K－Ras在前列腺癌中的表达国内研究较少，本研究显示前列腺癌组织的表达明显高于前列腺增生，但其与肿瘤的分化程度和浸润转移差异无显著性意义，说明K－Ras基因过表达在前列腺癌的发生中起一定促进作用。

B－Raf基因突变在甲状腺癌发生发展中有其独特而重要的作用［5，6］。目前国内在结直肠癌、恶性黑色素瘤及甲状腺癌中研究较多，但在前列腺癌组织研究较少。Yuen［7］研究发现，结直肠癌中分化程度越低B－Raf蛋白表达越高，Houben［8］研究发现BRaf的突变状态与恶性黑色素瘤的分期及预后呈正相关。本研究显示，B－Raf蛋白在前列腺癌组织表达明显高于前列腺增生，这说明B－Raf蛋白过表达与前列腺癌的发生有关。本研究还发现，B－Raf蛋白的过表达与前列腺癌的分化程度呈负相关，即分化程度越低B－Raf表达越高，与浸润程度呈正相关，即预后越差B－Raf蛋白表达越高。与Yuen和Houben研究的其他肿瘤的表达规律基本一致，BRaf蛋白的过表达预示着前列腺癌的预后较差。

如果Ras／Raf／MAPK信号通路中的某一成员发生突变，就会引起通路下游效应蛋白的功能发生改变，通路保持持续激活状态，必然会引起细胞异常增殖以及凋亡障碍等［4］。本研究发现，K－Ras与BRaf在前列腺癌的表达呈显著正相关，说明二者在前列腺癌的发生中起协同作用。他们中的一个因子或多个因子过度表达，都会激活Ras／Raf／MAPK信号通路，从而参与前列腺癌的发生发展。

［1］Adjei AA.Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy［J］.Natl Cancer inst，2001，93：1062.

［2］Liemann C.Regulation of MAP kinase activity by peptide receptor signalling pathway：paradigms of multiplicity［J］.Cell Signal，2002，13：777.

［3］Avruch J，Khokhlatchev A，Kyriakis JM，et al.Ras cactivition of the Raf kinase：tyrosine recruitment of the MAP kinase cascade［J］.Recent Prog Horn Res，2001，56：127.

［4］Norman KL，Hirasawa K，Yang AD，et al.Reovirus oncolysis：the Ras／RalGEF／p38pathway dictates host cell permissiveness to reovirus infection［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：11099.

［5］Mitsutake N，Knauf JA，Mitsutake S，et al.Conditinal－BRAFV600Eexpression induces DNA synthesis，apoptosis，dedifferentiation，and chromosomal instability in thyroid PCCL3cells［J］.Cancer Res，2005，65（6）：2465.

［6］Knauf JA，Ma X，Smith EP，et al.Targeted expression of BRAFV600Ein thyroid cells of transgenic mice results in papillary thyroid cancers that undergo dedifferentiation［J］.Cancer Res，2005，65（10）：4238.

［7］Yuen ST，Davies H，Chan TL，et al.Similarity of the phenotypicpatterns associated with BRAF and KRAS mutations in colorectal neoclassic［J］.Cancer Res，2004，62（22）：6451.

［8］Houben R，Becker JC，Kappel A，et al.Constitutive activation of the Ras－Raf signaling pathway in metastatic melanoma is associated with poor prognosis［J］.Carcinog，2004，3（1）：6.