EZH2在胃癌组织中的表达及与Hp－L型感染关系的探讨

赵淑芳 于东红

（蚌埠医学院第一附属医院病理科；蚌埠医学院病理学教研室，安徽233004）

EZH2是PcG（polycomb group）基因家族的核心成员，是果蝇zeste基因增强子的人类同源基因。EZH2通过抑制染色质中的靶基因控制细胞的记忆系统，从而促进细胞的增殖和扩散，与肿瘤的恶性程度和患者的预后密切相关［1－2］。幽门螺杆菌L型（Helicobacter pylori－L）是幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的细胞壁缺陷型。Hp可在胃液、胆汁、溶菌酶、抗生素等因素作用下发生细胞壁缺陷而形成Hp－L型。因多为球形幽门螺杆菌，故又称球形。已知Hp－L型的生物学性状和致病性与原菌有相似之处，也有明显不同，且与胃癌的发生有一定关系。目前国内外对EZH2蛋白在胃癌组织中的表达及意义以及EZH2与幽门螺杆菌及其L型感染相关性的研究报道较少，为此我们应用免疫组织化学、革兰染色和RT－PCR方法检测胃癌组织及其切缘组织中EZH2蛋白的表达、Hp及其L型感染的情况，旨在探讨胃癌EZH2的表达及临床意义，以及EZH2与Hp－L型感染的相关性。

材料和方法

1．一般资料

1．1收集2012年2月至2012年5月胃癌手术的新鲜标本30例（有转移的）及新鲜的远端正常组织（距肿瘤边缘组织约5cm处），术前未行放、化疗治疗，所有胃癌组织均在离体30min内切取，其中男性21例，女性9例，年龄55－79岁，中位年龄64岁，所有患者临床资料完整，病理资料均由2名病理主治医师复习。

1．2收集蚌埠医学院病理学教研室2010年12月－2011年6月外检档案中胃癌手术标本80例，其中男性60例，女性20例；年龄34－87岁，中位年龄60岁。组织学分级Ⅰ级＋Ⅱ级（高分化＋中分化）45例，Ⅲ级（低分化＋未分化）35例；有淋巴结转移者13例，无淋巴结转移者67例；癌组织未浸润至浆膜层11例，浸润至浆膜层69例；按照国际抗癌联盟（UICC）公布的TNM分期标准（2002年，第6版）进行分期：Ⅰ－Ⅱ期44例，Ⅲ－Ⅳ期36例。在该组病例中，随机选取30例胃癌两端切缘组织为正常对照。所有病例均满足如下标准：1）组织块按常规经10%中性福尔马林溶液固定、石蜡包埋，4μm连续切片数张；2）所有病例术前均未接受放疗或化疗；3）外科治疗均为根治性切除，存在无瘤切缘；4）病理诊断依据第4版WHO胃癌组织学分类标准。除做常规HE染色外，余做革兰染色、免疫组织化学染色。EZH2（多克隆）购于北京中杉金桥生物技术有限公司，ElivisionTMplus免疫组化试剂盒，购自福州迈新生物技术开发有限公司。Trizol Reagent（Invitrogen）、逆转录试剂盒、Marker、DEPC（Sigma）、琼脂糖、TBE等购自合肥志宏生物技术有限公司，EZH2基因引物、β内参引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。

2．方法

2．1EZH2检测

2．1．1采用免疫组化Elivision法：组织切片进行微波抗原修复，具体操作按说明书方法进行。用已知阳性片为阳性对照；用PBS替代一抗为阴性对照。结果判断：EZH2阳性显色以癌细胞胞核呈棕黄色颗粒为主，双盲法对染色结果进行评估，每例随机观察5个高倍视野（×400），每高倍视野计数100个瘤细胞。采用半定量积分法，将染色强度分为3级：无着色1分，浅着色2分，棕黄色3分；按阳性瘤细胞的百分比分3级：≤25%为Ⅰ级记1分，26%－75%为Ⅱ级记2分，≥76%为Ⅲ级记3分。每张切片最后的得分为两次评分的乘积（1－9分），≥3分为阳性，＜3分为阴性。

2．1．2RT－PCR 总 RNA 提取：取50－100mg组织匀浆后用Trizol提取液提取总RNA，取部分总RNA用紫外分光光度仪A260／A280，要求全部样本 OD260／OD280比值在1．8－2．0之间；cDNA 制备：操作过程参考逆转录试剂盒说明书进行，总RNA加入量为0．1－5μg，反应终体积20μl；PCR扩增：EZH2 基 因 上 游 引 物 5′－TCATGCAACACCCAACACTTA－3′，下 游 引 物 5′－CACCACTCCACTCCACATTCT－3′；β－actin 上 游 引 物 5′－CTGGGACGACATGGAGAAAA－3′，下 游 引 物 5′－AAGGAAGGCTGGAAGAGCGC－3′，反 应 条 件：95℃预变性5min后，以94℃45s变性，EZH2退火温度57．1℃，β－actin退火温度55．6℃，各进行45s，72℃延伸45s，反应35循环，最后一轮延伸7min。预期扩增产物大小分别为407bp和564bp。

2．1．3PCR产物判定：取5μl扩增产物用1．5%琼脂糖凝胶电泳（电压按100V，电流60mA），溴化乙锭（EB）显色，结果在GIS凝胶图像处理系统中拍摄记录，并使用图像分析软件行灰度扫描作半定量分析，以EZH2的吸光度值与β－actin吸光度值的比作为EZH2的基因表达半定量值。

2．2Hp－L型检测

革兰染色检测Hp－L型感染，油镜（10×100）观察并计数，每例随机观察10－15个视野，取平均数，Hp－L型和Hp平均数≥20为阳性，＜20或未查见Hp－L型和Hp为阴性，Hp－L型形态多样，大小不等，有巨形体、圆球体等。革兰染色阴性呈红色，阳性呈紫红色，Hp－L型大多数呈革兰染色阴性（红色），少数Hp－L型革兰染色阳性（紫红色）；Hp则呈螺旋形、“S”形或海鸥形，革兰染色阴性（红色）。革兰染色L型细菌检出和免疫组化Hp－L型抗原表达同时阳性者定为Hp－L型感染阳性。每例标本同时用免疫组化法检测Hp－L型抗原的表达，Hp－L型多克隆抗体由蚌埠医学院微生物教研室制备，工作浓度为1∶100。用已知Hp－L型阳性切片作为阳性对照，用PBS替代一抗为阴性对照。Hp－L型免疫组化的阳性标准为：胃癌细胞、正常胃黏膜上皮细胞及间质巨噬细胞的胞质或胞膜着棕黄色为Hp－L型阳性，常呈细颗粒状，不着色为阴性。革兰染色Hp－L型检出和免疫组化Hp－L型抗原表达同时阳性者定为Hp－L型感染阳性。

2．3统计学处理

采用SPSS17．0统计软件对相关的数据资料进行统计学处理：计数等级资料采用t检验、χ2检验和单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．胃癌的EZH2表达及与临床病理因素的关系

EZH2蛋白在胃癌中的表达阳性率为62．5%（50／80）；显著高于对照组（8／30，26．7%），两者比较具有统计学意义（P＜0．01，表1），经χ2检验，胃癌组织中EZH2的表达与患者的年龄、性别、肿瘤细胞分化程度无关，而与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移和临床分期相关（均P＜0．05，表2，图1，2）。

表1 不同组织中EZH2蛋白的表达情况Table 1 The expression of EZH2in different gastric tissues

表2 胃癌组织EZH2蛋白表达与临床病理学特征的关系Table 2 Relationship between the expression of EZH2and clinical pathological characteristics in gastric carcinom

2．EZH2扩增产物与内参基因电泳结果

胃癌组织和对照组组织中均可在凝胶成像仪下见到扩增的EZH2条带（407bp处），但肿瘤组织的较对照组组织稍清楚（见图3），并同时用电泳β－actin内参（564bp处）和DNA标准分子量标记物（DNA Marker）作为参照和标尺。经过凝胶成像分析仪扫描后，对30例胃癌患者EZH2／β－actin电泳条带吸光度比值（mRNA水平相对值一目的条带吸光度值／内参β－actin条带吸光度值），进行统计学分析，胃癌组织中EZH2mRNA的表达量为0．9117±0．0765，远端正常对照组织的表达量0．7535±0．0716，胃癌组织中EZH2mRNA显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0．01）。

图3 EZH2mRNA的琼脂糖电泳图（1、3、5为胃癌组，2、4、6为对照组）Fig．3Agarose electrophoresis of EZH2mRNA （1、3、5for the GC group，2、4、6for the controls group）

3．胃癌中Hp和Hp－L型的检测结果及分布

胃癌组中有63例革兰染色检出L型，仅7例同时检出L型和 Hp，检出率分别为78．8%（63／80）和8．8%（7／80）。免疫组织化学法 Hp－L型抗原表达阳性见图5，其阳性率为73．8%（59／80），与革兰染色L型检出的阳性率具有一致性（P＞0．05）。80例胃癌组织中Hp－L型阳性（即革兰染色L型检出阳性和免疫组化Hp－L型抗原表达同时阳性）的病例数为57例，其阳性率为71．3%。对照组中有10例革兰染色同时检出Hp和L型，免疫组化Hp－L型抗原表达阳性为7例，两种方法检测同时阳性（即Hp－L型阳性）的有7例，阳性率为23．3%（7／30），Hp检出阳性率为30%（9／30），经统计学处理与Hp－L型检出阳性率差异无显著性（P＞0．05）。从表3可见胃癌组中Hp－L型阳性率（71．3%）高于对照组（23．3%），两者有统计学意义（P＜0．01）。观察革兰染色切片发现，Hp－L型主要存在于胃癌癌巢和癌旁，癌细胞的胞浆内也可查见，癌巢的坏死处几乎无Hp－L，正常组织内也较少见。Hp则主要存在于正常组织内，呈螺旋形，“S”形和海鸥形，癌巢、癌旁较少，癌巢的坏死处几乎无Hp。Hp－L型大部分是革兰染色阴性，多数呈圆球形，可在癌巢、癌间质或黏膜层聚集成堆，也可散在分布于其中，也可见到L型黏附于癌细胞表面的现象（图4）。

4．胃癌中Hp－L型感染与EZH2蛋白表达的关系

从表4可见，胃癌Hp－L型阳性组的EZH2表达明显高于其Hp－L型阴性组，应用Spearman秩相关检验，两者之间呈正相关（r＝0．250，P＜0．05）。

表3 不同组织中Hp－L检测情况Table 3 The result of Hp－L detected in different gastric tissues

表4 80例胃癌组织中Hp－L感染与EZH2蛋白表达之间的关系Table 4 The relativity between Helicobacter pylori L－formt infection and he expression of EZH2in80samples of gastric carcinoma

讨 论

EZH2作为PcG（polycomb group）基因家族的核心成员，是果蝇zeste基因增强子的人类同源基因。EZH2与细胞生长调节相关，通过抑制染色质中的靶基因而调节细胞增殖，作为转录阻遏因子，控制细胞的记忆系统。近年研究表明，EZH2基因的过表达与细胞的过度增殖乃至肿瘤发生有关。Croonquist［3］等报道显示，在多种实体瘤中存在着过表达并与肿瘤的生物学行为及预后有关，故认为EZH2基因是一个候选的癌基因。EZH2能够促进细胞增殖、肿瘤细胞扩散，在许多恶性肿瘤中存在不同程度的高表达。包括骨髓肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌等，并与肿瘤 的 侵 袭 转 移 和 预 后 有 关［1－2］。 有 研 究 报 道［4－5］EZH2可促进胃癌细胞增殖，可以推测，EZH2参与胃癌发生、发展的机制之一可能与其促进增殖能力有关，这与恶性肿瘤中的研究结果一致。Chen等［6］研究显示，EZH2在胃癌组织中的表达可达到56．6%，并且肿瘤的大小、浸润深度、淋巴结转移、侵犯血管致血运转移及临床分期都可影响其表达水平。Mccabe等［7］研究发现，胃癌有无远处转移和EZH2表达水平的高低有关，玄东春［8］等研究显示，EZH2表达水平与胃癌的进展有关，进展期胃癌组织中EZH2的表达水平明显高于早期胃癌。本研究采用免疫组化法检测了80例胃癌组及30例对照组的EZH2蛋白表达情况，应用RT－PCR检测30例新鲜胃癌组及30例对照组的EZH2mRNA表达，发现EZH2在胃癌组中表达明显增高，而且EZH2表达增高与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、分化程度和TNM分期有关，与文献结果基本一致。提示EZH2可能参与了胃癌的发生、发展，并且对胃癌的预后评估有很大帮助。

幽门螺杆菌（Hp）已被公认为慢性胃炎、消化性溃疡的致病因素，也与胃癌的发生密切相关。Hp主要定植于人胃黏膜，在不利于其生长繁殖的环境中易发生细胞壁缺陷而形成幽门螺杆菌L型（Hp－L），Hp－L型对环境抵抗力强，是Hp适应外界不良条件的一种自我保护形式［9，10］，Hp－L型的生物学性状与原菌相比也有很多相似处，Figueroa等［11］用免疫印迹证明Hp－L型可能与原菌一样具有免疫功能。进一步研究证明，Hp－L型抗原与原菌相比仅有量的减少，或仅有某些细胞壁抗原成分的缺失而无质的变化，甚至比原菌的致病性要强。Cellini等［12］用 Hp－L 型感染BALB／c小鼠，2周后可见鼠胃内有Hp－L型的定居，1个月后引起胃组织学改变，并使小鼠产生抗Hp的抗体。宣兰兰等研究［13］证实Hp－L型可以抑制胃癌细胞的凋亡，从而促进肿瘤的发生。周蕾等［14］对120例胃癌进行 Hp－L型检测发现，胃癌组 Hp－L型检出率（68．33%），结果提示Hp－L型感染是影响胃癌侵袭和转移的重要因素之一。本研究对80例胃癌、30例切缘对照胃黏膜进行Hp－L检测，结果有57例胃癌检出Hp－L，15例同时检出Hp和L型，仅5例单纯Hp检出阳性，说明Hp在患者体内易发生L型变异，多数是以Hp－L型的形式存在。Chan等［15］研究也发现，胃癌组织中Hp通常以L型的形式存在，且在癌变组织中的检出量远高于溃疡病患者。本研究革兰染色切片在油镜下均见到Hp－L型位于胃黏膜的浅表胃小凹内、胃癌腺体内及胃癌细胞内，说明Hp－L型在胃癌的发生和进展过程中可能以一种播散侵入的方式而定植，这一结果与胃溃疡中的Hp－L型感染情况相近［17］。

我们对Hp－L型感染和EZH2表达的关系进行研究和分析，发现Hp－L型阳性组中EZH2表达阳性的例数较Hp－L型阴性组中EZH2表达阳性的例数明显增多，数据采用卡方检验分析P＜0．05，两组之间的差异有统计学意义，说明Hp－L型感染可促进胃癌组织中EZH2的表达，并且是胃癌发生的一个危险因素。至于EZH2和Hp－L型具体致癌机制及二者之间的相互作用机理有待进一步研究。

图 版 说 明

图1 EZH2蛋白在胃腺癌中的表达阳性，主要表达于细胞核（A，HE×100；B，Elivision×100；C，HE×400；D，Elivision×400）

图2 EZH2蛋白在切缘正常组织中的表达阴性，细胞核不着色（A，HE×100；B，Elivision×100；C，HE×400；D，Elivision×400）

图4 正常胃组织内的Hp及Hp－L型（A）及胃腺癌中的Hp－L型（B）。Hp呈螺旋形、“S”形或海鸥形。Hp－L型位于癌细胞内及癌细胞旁，呈圆球状，有圆球体、巨形体和原生小体等（箭头）（革兰氏×1000）

图5 Hp－L型抗原在胃腺癌中的阳性表达，主要表达于细胞浆（Elivision×400）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1Positive expression of EZH2in the nuclei of adenocarcinoma cancerous tissue（A，HE×100；B，Elivision×100；C，HE×400；D，Elivision×400）

Fig．2negative expression of EZH2in the nuclei of normal gastric mucosa tissues（A，HE×100；B，Elivision×100；C，HE×400；D，Elivision×400）

Fig．4Hp and Hp－L form in Normal and adenocarcinoma gastric tissue of Hp were spira，“S”－shaped or seagull shape，Hp－L form cylindrical and spherical，the sphere，giant body and native body（arrow）（Gram stain×1000）．

Fig．5Positive expression of Helicobacter pylori L－form in gastric adenocarcinoma（Elivision×400）

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