一株拮抗放线菌T151的鉴定及其抑菌活性物质分析

李晓凤 李淑英 聂莹 杜欢 杨帆 童大磊 韦日清 赵仲麟 唐选明

（1. 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193； 2. 内蒙古农业大学，呼和浩特 010018； 3. 河南农业大学理学院，郑州 450002）

从微生物代谢产物中寻找控制有害生物的生物农药是新农药研究的一个重要方向[1]。随着环境保护、绿色食品及农业可持续发展的需要，农用抗生素作为低毒低残留的生物农药日益受到人们的重视[2]。目前，从微生物中发现的大约8 000种生物活性物质中近70%是由放线菌产生的[3]。

T151是从土壤中分离纯化得到的一株具有抑菌活性的放线菌，为了研究该菌株是否具有潜在生防利用价值和田间应用前景，我们对发酵液中活性代谢产物的抑菌作用范围及其在不同条件下抑菌活性的稳定性作了初步分析，旨在为T151的进一步研究和应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 放线菌T151本实验室从海南海口市郊的土壤中分离得到；指示菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和根霉（Rhizopus）均由本实验室保存。

1.1.2 仪器 恒温培养振荡器（ZHWY-200H，上海智城分析仪器制造有限公司）、电热恒温培养箱（DHP-9082型，上海一恒科学仪器有限公司）、立式压力蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-50A，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、三目生物显微镜（XSP-BM10A，上海光学仪器六厂）、大型离心机（CR22GⅡ，日本日立）、透射电子显微镜（H-T500，日本日立）。

1.1.3 培养基 根霉培养基：PDA培养基。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌培养基：LB培养基。T151发酵培养基：淀粉2%、黄豆饼粉0.2%、大米粉0.2%、葡萄糖0.5%、酵母粉0.2%、KNO30.2%、NaCl 0.1%、K2HPO40.1%、MgSO40.05%、CaCO30.3%。 所 有 培养基均在120℃下灭菌40 min备用。

1.2 方法

1.2.1 菌种鉴定 形态学鉴定：采用埋片法[4]在发酵培养基上培养菌株T151，用光学显微镜和扫描电子显微镜观察拍照。分子生物学鉴定：提取T151的基因组，放线菌16S rDNA扩增引物及方法参照文献[5]，扩增片段送Invitrogen公司测序。测序结果在NCBI网站利用Blast进行比对，调出相似序列，用Clustal X1.83和MEGA 3.1 软件构建系统发育树[6]。

1.2.2 抑菌活性分析 采用管碟法[3，7-9]，分别以大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和根霉为指示菌，测定T151发酵液的抑菌活性。试验重复3次，以十字交叉法测量抑菌圈直径大小。

1.2.3 发酵液活性物质稳定性分析 以枯草芽孢杆菌为指示菌，采用管碟法测定发酵液在不同条件下处理后的抑菌活性，根据抑菌圈直径的改变确定其稳定性[3，9-11]。

热稳定性分析：各取发酵液2 mL，分别置于80℃、90℃、100℃和110℃条件下加热20 min和30 min，测抑菌活性，试验重复3次。

酸碱稳定性分析：各取5 mL发酵液，分别用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH调节pH，分别调到pH为3、5、7、9、11和12，并放置于冰箱4℃，12 h，然后将各pH调回7左右，测抑菌活性，试验设3个重复。

2 结果

2.1 T151菌种鉴定结果

2.1.1 形态特征 T151菌落紧密、多皱，菌丝体呈淡紫灰色。如图1所示，光学显微镜下菌丝体呈直立或柔曲。如图2所示，扫描电镜下其孢子丝呈链状直丝，孢子表面光滑无突起，孢子呈圆柱状两端方正平滑，参照《链霉菌鉴定手册》，该菌株总体表现为链霉菌属特点。

图1 T151光学显微镜形态观察

图2 T151电子显微镜形态观察

2.1.2 16S rDNA序列分析及系统发育构建 PCR扩增所得T151菌株16S rDNA全长1 486 bp，将T151的16S rDNA测序结果经Blast 比对，与T151菌株16S rDNA同源性较高的菌株均为链霉菌属放线菌，从中选择15条同源性高于99%的16S rDNA序列构建系统发育树，如图3所示，T151菌株与Streptomycessp. SHXFF-2 partial 在同一分枝上，结合菌株形态特征，初步鉴定T151为链霉菌新种。

2.2 T151发酵液抑菌活性分析

从表1可以看出，T151的发酵产物对3种指示菌均有明显的抑菌活性。对G-细菌大肠杆菌的抑菌效果最好，抑菌圈面积为593.66 mm2；其次为G+细菌枯草芽孢杆菌，抑菌圈面积达到490.63 mm2；对真菌根霉也有明显的抑制作用，抑菌圈面积为200.96 mm2。

2.3 T151发酵液的稳定性分析

图3 T151的系统发育树

表1 T151发酵液对3种指示菌的抑制效果

2.3.1 热稳定性 如图4所示，随着对T151发酵液处理温度的升高，处理时间的延长，抑菌圈直径减小。菌株T151发酵液分别在80℃、90℃和100℃处理20和30 min，抑菌活性变化不是很大；而发酵液在110℃条件下处理20 min后，抑菌活性大幅度降低，处理30 min后活性消失。以上结果表明，T151发酵液在80-100℃内相对稳定性，而当温度升高到110℃时，稳定性急剧下降。

图4 T151发酵液的热稳定性

2.3.2 酸碱稳定性 如图5所示，T151发酵液在pH5-11条件下抑菌活性比较稳定，抑菌圈直径几乎没有变化，而pH 在3和12时，抑菌效果明显降低，特别是在碱性环境下。说明T151发酵液中活性成分对强酸强碱的稳定性较差。

图5 T151发酵液的酸碱稳定性

3 讨论

随着对土壤放线菌代谢特性的深入研究，以及分离和培养方法的进一步改进，越来越多的土壤放线菌将得到分离，土壤放线菌丰富的多样性将不断地被揭示。链霉菌一直被认为是产生各种抗生素的主要来源。遗传多样性分析表明，链霉菌属可产生的抗生素约有上万种，而目前发现的只是很小一部分。随着微生物对已有抗生素抗药性的增加，人类对新的药物资源的需求越来越迫切。但随着已经发现的微生物源化合物数量的增加，从普通环境中分离筛选新的活性物质产生菌的难度日益上升。可见，从土壤环境中筛选稀有菌种已经成为当前微生物资源开发利用的重要研究课题。

本研究所用放线菌T151是从海南海口市郊的土壤中分离得到，综合形态学特征和分子生物学鉴定，该菌株属于链霉菌属。抑菌试验结果表明，该菌株发酵液具有广谱的抗菌活性，对G+细菌、G-细菌和真菌均有较强的抑制作用，并且对细菌的抑菌作用强于对真菌的抑菌作用。稳定性分析表明，发酵液中具有抗菌作用的活性成分对热、酸碱具有极强的稳定性，这些研究对于活性物质的进一步分离、纯化、结构解析和功能研究等提供了理论依据。

后续研究中，还有待对该菌种进行系统的鉴定；还需要分离纯化活性成分，对活性成分进行鉴定和系统的抗菌谱研究等。

4 结论

T151的形态学观察表明，该菌株具有典型的链霉菌属特征；16S rDNA鉴定结果证实，该菌株与Streptomycessp. SHXFF-2 partial处于同一分枝上，是链霉菌属新种；发酵液的抗菌活性研究表明，T151的发酵液具有较强的抗菌活性，该菌株对G+细菌枯草芽孢杆菌、G-细菌大肠杆菌和真菌根霉均有较强的抑制作用；稳定性分析表明，T151发酵液具有较强的热、酸碱稳定性，具有较强的可操作性。

［1］ 功能.生物农药发展的机遇与挑战［J］. 中国生物防治, 2001（4）：184-185.

［2］ 张化霜. 微生物农药研究进展［J］. 农药科学与管理, 2011（11）：22-25.

［3］ 徐林波, 狄彩霞, 刘爱萍, 等.放线菌TL05-22菌株发酵液的抑菌谱及稳定性［J］.农药, 2011（1）：35-37.

［4］ 徐立华, 李文均, 刘志恒, 等. 放线菌系统学——原理、方法及实践［M］.北京：科学出版社, 2007：40-46.

［5］ 闫建芳, 齐小辉, 高晓梅, 等. 拮抗放线菌B-20的种类鉴定及其16S rDNA序列分析［J］.微生物学杂志, 2008（3）：26-29.

［6］ 蒋茜.海洋放线菌GY-4的鉴定及其抗菌物质研究［D］.南京：南京农业大学, 2011.

［7］ 王磊, 孙晗笑, 李秀英, 等.具有抑菌作用的放线菌GNF1的分离鉴定和生物学活性的研究［J］.生物技术通报, 2011（4）：147-152.

［8］ 刘莲娜, 孙伟明, 郭巍, 等.一株新的拮抗细菌SL19及其抑菌活性物质［J］.微生物学通报, 2011（8）：1199-1206.

［9］ 李璐宁, 张薇, 赵永强, 等.放线菌Y23菌株发酵液抗菌活性及稳定性测定［J］.山东农业科学, 2009（1）：71-74.

［10］ 张荣柳, 蒲小明, 沈会芳, 等.海洋放线菌H23-16活性代谢物的提取及其稳定性研究［J］.安徽农业科学, 2012（1）：6-7.

［11］ 任娜敏, 马焕普, 刘志民.拮抗放线菌F1发酵液抑菌谱及稳定性分析［J］.北京农学院学报, 2012（1）: 32-35.