小麦种子萌发时期胚差异蛋白表达分析

刘向标 段江燕

（山西师范大学生命科学学院，临汾 041000）

种子的萌发是植物生长的最关键时期。种子萌发时蛋白质的变化反映了植物基因组第一次被激活基因的表达情况［1］。高等植物中，种子在整个生命周期中占据着重要的地位，生物体在不同的发育阶段会合成和分解类型和数量不同的蛋白质，这些动态变化的蛋白质构成了生物体某一时刻特征性生命活动的基础，是认识生命活动本质的一个恰当而直接的途径［2］。国内外对小麦在多种胁迫条件下的形态结构、生理生化机制方面进行的研究已经深入到DNA、蛋白质分子水平［3，4］。在外界胁迫的影响下，使种子体内的一些蛋白质的合成受到抑制，同时也促使一些新的蛋白质的合成引发种子体内的代谢变化［5］。但萌发的调控等一系列复杂的生理生化过程如何相互协调还不甚清晰，成熟的种子蛋白质作为生命活动的执行者，既能反映基因组被激活后基因的表达情况，同时又能反映种子相对静止状态到活跃的生理生化代谢的转变过程。为此，通过对小麦种子萌发不同时间的差异蛋白的研究，对探讨小麦种子萌发机制具有重要意义。

蛋白质组学技术为研究蛋白质的动态变化提供了重要的技术支撑，可对生物细胞或组织蛋白质表达进行定性或定量的综合分析，尤其可用于揭示不同条件下蛋白质表达的变化。该技术具有高通量、高灵敏度、高分辨率、重复性好等优点［6］。核心技术包括双向电泳技术（two-dimensional electrophoresis，2-DE）和质谱技术（mass spectrometry，MS）［7］。目前该技术方法仅在拟南芥、大麦、橡胶种子等少数植物有相关报道［8］。但尚未见对小麦种子不同萌发时期差异蛋白质组和质谱分析的报道。

本试验以“晋麦-47”为材料，比较小麦种子萌发前期胚蛋白质表达的差异，并进行质谱鉴定，揭示种子从相对静止状态到活跃状态过程中涉及的差异蛋白表达情况，以期为小麦种子萌发的调控机制研究提供参考。

1 材料与方法

1. 1 材料

小麦种子（晋麦-47）由山西省农科院小麦研究所提供。 主要试剂：Triton X-100、超纯水、蒸馏水、丙酮、过硫酸铵（AP）、尿素、硫脲、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟基甲基氨基甲烷（Tris）、N、N、N'、N'四甲基乙二胺（TEMED）、0.1% HgCl2、牛血清蛋白（BSA）、冰乙酸、甘油、两性电解质（Bio-Lyte）1%溴酚蓝、1 mol/L盐酸、CHAPS、碘乙酰胺（IAM）、低熔点琼脂糖、甘氨酸、丙烯酰胺（Acr）、85﹪磷酸、二硫苏糖醇（DTT）、95﹪乙醇、考马斯亮蓝G-250和甲叉双丙烯酰胺（Bis）

1.2 方法

1.2.1 不同萌发时期小麦种子胚样品的制备 选取干燥度一致、饱满、种皮色泽正常的种子650 粒。（经0.1% HgCl2溶液浸没消毒2 min后再用纯水漂洗5次），置于25 mL纯水，铺有双层定性滤纸的玻璃培养皿中，每皿50 粒，盖上盖。25℃恒温避光处理发芽。随机选取吸胀后0、0.5、1、2、3、5、7、10和13 h，之后每隔3 h取一次直至25 h胚根突破种皮2-3 mm为止，测定种子的鲜重和干重，均重复3次，初步确定小麦胚的选取时期。

1.2.2 蛋白样品的提取 用尿素/硫脲法提取小麦胚蛋白，把在不同时期取出的小麦胚样品在液氮中磨成粉末加入离心管中，加入尿素/硫脲蛋白提取液振荡30 s，离心15 min后，取上清液再重复离心，收集上清液，加入3倍体积冷丙酮，并放入-20℃的冰箱里过夜，次日后收集沉淀（视具体情况可再加一次，离心同上），4℃放置，使丙酮充分发挥，待沉淀干燥后，溶于400 µL样品裂解液，4℃冰箱中过夜，第二天离心取上清液，得到蛋白质样品液，4℃放置待用。

1.2.3 小麦种子胚可溶性蛋白的双向电泳 取出已经配好的水化上样液，加入0.001 g DTT，5 µL的40% Bio-Lyte（pH3-10），充分溶解，取均质的水化上样液与蛋白样品溶液以4∶1混匀，即为上样液。采用pH3-10，7 cm线性IPG预制胶条。主动水化在50 V电压下12 h后，经过250 V 0.5 h、500 V 0.5 h、4 000 V 3 h、最后稳定在4 000 V下进行20 000 Vh，500 V快速保持时间视情况而定。聚焦完毕后，胶条先在平衡液Ⅰ［尿素36 g、SDS 2 g、Tris-HCl（pH8.8）25 mL、甘油20 mL、DTT 0.2 g］中，在摇床上平衡15 min，再在平衡液Ⅱ（0.25 g IAM代替0.2 g DTT，其余组分同平衡Ⅰ）中平衡15 min。然后进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为12%。

1.2.4 考马斯亮蓝染色 剥离凝胶立即放入固定液（12% TCA）中固定2 h，充分固定后用双蒸水洗3次，每次5 min，取出放入考马斯亮蓝染液（20﹪甲醇、1.8%磷酸、8﹪硫酸铵、0.08%的考马斯亮蓝G250染色至少2 h，脱色液（7﹪、5﹪甲醇）脱色1 h后换用双蒸水进行脱色，直到蛋白点清晰为止。

1.2.5 2-DE图像分析 凝胶用扫描仪（UMAX）进行扫描，得到蛋白图像用PDQest软件进行分析包括背景消减、斑点检测、匹配、获取斑点位置坐标和蛋白质点的标准化分析等。

1.2.6 蛋白质点胶内酶解及肽指纹图谱分析 选取重复性较好的差异表达量在2.5倍的蛋白点进行胶内酶解，将酶解肽段重新溶解于0.7 μL 0.5g/L的CHCA溶液（0.1%TFA+50%ACN）中，在靶板上点样。样品用4700串联飞行时间质谱仪进行质谱分析。所得质谱结果用GPS-MASCOT软件进行数据库检索。

2 结果

2.1 小麦种子胚萌发前期取样时间的确定

根据萌发过程中小麦种子含水量的不同，将分为3个时期，分别是第一时期吸胀吸水期，第二时期缓慢吸水期，第三时期生长吸水期。生长吸水时期的胚根突破种皮2-3 mm，分别测定13个时间段种子干重和湿重，得到“晋麦-47”种子的含水量（图1）同时间的关系，以初步确定小麦种子萌发前期的取样时间。从图中可看到小麦种子萌发前期的3个阶段，分别是从0 h（干种子）-3 h，种子含水量快速从0 g增加到0.06 g；3 h-16 h，种子含水量缓慢增加，从0.06 g增加到0.19 g；17 h-25 h（胚根突破种皮2-3 mm）种子含水量快速从0.19 g增加到0.24 g。87%的种子露白发生在第三个阶段，表明小麦种子出芽时间比较集中。为此，将种子萌发前期过程中蛋白质的取样时间初步定在0、3、16和25 h。

图1 小麦种子萌发过程水分含量的变化

2.2 小麦种子总蛋白提取的方法比较

本试验分别采用酚提-甲醇/醋酸铵沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和尿素硫脲法提取小麦种子中胚蛋白，为确定合适的提取方法每个方法重复3次。分别进行SDS-PAGE（图2），结果显示，不论在蛋白条带的数目还是染色的深浅方面，3种蛋白提取方法得到的蛋白样品均有所不同。酚提-甲醇/醋酸铵沉淀法对种子中胚蛋白的提取效果明显弱于TCA/丙酮沉淀法和尿素硫脲法。从图2还可看出，在高分子量区，TCA/丙酮法的提取效果不如尿素硫脲法，因能明显看到这种方法在此范围会丢失部分蛋白，相比较而言，尿素硫脲提取的蛋白更加完整。

图2 不同提取方法的SDS-PAGE分析结果

2.3 小麦种子萌发过程中蛋白含量的变化

为了进一步探究小麦种子萌发过程中蛋白含量的变化，本试验分别采用0、0.5、1、2、3、5、7、10、13、16、19、22及25 h的小麦种子作为材料，用尿素硫脲法进行总蛋白的提取，进行SDSPAGE分析（图3）。结果显示，不论是3 h、16 h和25 h，小麦种子胚蛋白的含量与未萌发的相比，含量均有所上升，萌发3 h时与0 h的差异不显著；萌发16 h时，与0 h相比其差异显著；萌发25 h后，与0 h相比差异极显著。因此，将种子萌发前期过程中胚蛋白质的取样时间定在0、3、16和25 h 4个时期是合理的。

图3 不同时段小麦种子胚蛋白的SDS-PAGE分析结果

2.4 不同萌发时期小麦种子蛋白的双向电泳图谱分析

通过严格一致3次重复的双向电泳操作获得0 h、3 h、16 h和25 h等 4个时期重复性较高的2-DE电泳图谱（图4），在pH3-10，分子质量14.4-94.0 kD范围，利用PDQuest软件分析0 h与3 h的蛋白点相关系数（Correlation coefficient）为86.3%，与16 h的为84.9%，与25 h的为83.7%，说明蛋白质渐近变化。

2.5 差异表达蛋白的MALDI-TOF-MS分析及数据库检索

图4 “晋麦-47”萌发前期不同时期种子胚蛋白质2-DE电泳图谱

2-DE凝胶上面的蛋白点相对量随着小麦种子萌发初期发育进程的出现与否和表达量的增减，通过PDQuest软件分析出对重复性、表达量变化超过2.5倍以上的9个差异蛋白质点进行MALDI-TOF-MS分析，以基质峰、酶自动降解片段峰进行校正，去掉角蛋白峰和胰酶自切峰，精确标定强度为基质峰强度2倍以上的峰，9个蛋白点均获得肽质量指纹图谱（PMF），图5是蛋白点6的肽段串联质谱图。共鉴定得到4个差异蛋白（表1）分别为核苷二磷酸激酶Ⅰ、17.5 kD热休克蛋白、ATP合酶和LEA蛋白27。

图5 ATP合酶质谱图

表1 差异表达蛋白的查询结果

3 讨论

3.1 小麦种子萌发过程中蛋白取样时期的确定

选择合适的时期进行蛋白取样，对后续的蛋白质组学分析至关重要。种子萌发分为吸胀吸水期、缓慢吸水期、生长吸水期。种子细胞在不同发育阶段的蛋白质在种类和数量上是不同的，反映在种子萌发过程中不同阶段的发育特点上。通过对不同时期小麦种子含水量指标的测定，初步选定0、3、16和25 h作为取样时期。据此，进一步结合13个不同时期的蛋白样品进行SDS-PAGE检测，把吸胀0 h作为休眠干种子代表时期，吸胀3 h作为吸胀吸水期的代表，吸胀16 h作为缓慢吸水期的代表，吸胀25 h作为生长吸水期的代表。因此，分别在0 h、3 h、16 h和25 h等4个时期进行蛋白取样。

3.2 小麦种子萌发过程中胚差异蛋白分析

植物在生长时期表现出来的蛋白质动态变化，共同构成了细胞各个时期生命的基础。小麦种子在萌发时期的蛋白质变化，反映出小麦基因组从休止到开启、翻译、表达的过程。因此，了解蛋白质的变化为认识生命活动本质提供了一个直接途径［9］。

与种子生长、能量代谢相关的蛋白：蛋白点1被鉴定为核苷二磷酸激酶Ⅰ（NDPKⅠ），在小麦种子萌发16 h时表达量增加，一直到25 h保持着较高的表达水平，表明此时核酸合成活跃，维持细胞核内NDP和NTP代谢的平衡（NTP +NDPK= NDP+NDPK-P；N=G、T、C、U）进行磷酸化与脱磷酸化反应［9］，有利于种子的生长；蛋白点6被鉴定为ATP Synthase（ATP合酶），在种子萌发25 h表达量最高，此时胚根突破种皮需要消耗大量能量。研究表明，ATP合酶在线粒体和细菌中广泛存在［11，12］，依靠质子动力势合成ATP也能水解ATP形成机体重要的质子梯度，其主要功能是合成ATP。

与种子抗性和抗氧化性相关蛋白：蛋白点3被鉴定为17.5 kD热激蛋白（HSP），在25 h大量表达，可能是与打破休眠后保护萌发过程中细胞膜结构系统和抗氧化系统免受伤害，保证小麦种子的顺利萌发。研究表明，HSPs的生成与生物耐热性相关，HSP105在热激时能迅速移到核内，并在核仁和核质中积累，在热激解除时，又迁到细胞质中具有保护细胞机体免受损害的作用［10］；蛋白点8被鉴定为27 kD种子成熟蛋白在25 h时出现，可能与GmPM4一样供种子萌发时维生素的需求，绝大部分种子成熟蛋白属于LEA蛋白家族成员（如GmPM1、GmPM8和GmPM9等）都有LEA蛋白保守机构域，种子成熟蛋白GmPM4含有TENA-THI-4保守结构域，属于硫胺（维生素）家族［13］。Roy等［14］曾报道，Gm-PM4可作为维生素的一种贮藏形式供种子萌发所用。

4 结论

本研究发现“晋麦-47”小麦种子未萌发和萌发3 h、16 h和25 h的胚的2-DE凝胶通过PDQuest图像分析软件可识别的蛋白点约有127、131、135和141个，其中表达量变化2.5倍以上的蛋白点有17个，选取表达量在2.5倍以上的9个差异蛋白点进行质谱鉴定，初步鉴定出4个蛋白质分别是核苷二磷酸激酶Ⅰ、17.5 kDa热休克蛋白、ATP合酶和LEA蛋白27，分子量分别为16.0、18.3、12.3和26.5 kD；等电点分别为6.9、6.2、5.8和6.2。

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