UV-B辐射对小麦叶片蛋白的影响

齐婷婷 段江燕

（山西师范大学生命科学学院，临汾 041000）

由于近20年全球平均臭氧层减少了2%-3%［1］，从而导致到达地表的太阳紫外辐射（UV-B）增强，影响了地球上动植物以及人类本身。有关UV-B辐射对植物的影响，国内外学者已研究了大约400种植物的相应变化反应［2］。

小麦作为我国北方重要的粮食作物之一，许多学者关注了UV-B辐射对它的影响［3］，何丽莲等［4］研究了10个小麦品种对UV-B辐射增强响应的生长和产量差异。马晓丽等［5］对小麦经UV-B辐射和He-Ne激光修复后其叶片蛋白和核酸含量等变化进行了研究。黄修文等［6］对UV-B辐射处理过的小麦幼苗期叶片的蛋白质组进行了分析。李元等［7，8］研

究了不同生长时期小麦的生长变化，陈建军等［9］集中于研究小麦某个品种的特定时期或者不同品种小麦的特定时期的生长变化，而对于小麦幼苗经受不同天数UV-B辐射后的生长变化和自我修复过程及差异蛋白的研究很少。因此本研究对不同天数UV-B辐射下小麦叶片生长指标的变化过程进行初步研究和分析，以明确植物对不同天数UV-B辐射后的适应性反应及其自我修复生长过程。

1 材料与方法

1.1 材料

紫外B 组发生用紫外-B 灯（秦牌，宝鸡制造，8 W，297 nm）模拟增强UV-B 辐射，将其垂直悬于培养皿的上方，通过调整UV-B灯与植物之间的距离来控制UV-B 辐射的强度，辐射强度0.82 W/m2，照射20 min，UV-B 剂量约为1 KJ/m2· d 。采用紫外辐照计（UV-B 型，北师大光电仪器厂）对UV-B 辐射功率密度进行测定，仪器预先用742 型辐射强度测定仪（FL，USA）进行校正。

晋麦47号（Triticum aestivum，jinmai47）由山西省农业科学院小麦研究所提供。 选取籽粒饱满，大小均一，生活力较好的小麦幼苗，培养于盛有湿滤纸的培养皿内，30粒/盘，每组3次重复，25℃恒温培养箱中培养。种子露白时待处理。共设对照（CK）、UV-B处理（B）2组（表1）。

表1 各处理组的设置及处理程序

1.2 方法

1.2.1 叶片指标测定 小麦处理3 d后，每隔1 d按常规法对叶片长度进行测量并求其平均值、称其叶片重量、用ADC便携式叶面积仪测培养皿内每片叶面积并计算出平均叶面积。

1.2.2 叶片总蛋白含量测定 取0.2 g粉末溶于1.5 mL蛋白质提取液，搅动30 s，离心（12 000×g，4℃，15 min），取上清夜再重复离心，收集上清；加3倍体积冷丙酮，-20℃放置过夜；离心（12 000×g，4℃，15 min）。收集沉淀，挥发去丙酮，用样品裂解液裂解。蛋白浓度定量参照Bradford（1976）方法建立标准曲线和测定样品的蛋白浓度。

1.2.3 叶片聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 选取具有代表性的UV-B辐射天数，提取小麦叶片总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再用凝胶分析软件进行分析。

1.2.4 双向电泳 蛋白质含量约300 µg的蛋白质提取液，按1∶4的比例加入水化上样液；聚焦盘中加入样品混合液200 µL；去除保护膜的预制7 cm IPG胶条，主动水化16 h，两次1 h的除盐，20 000伏小时（Vh）聚焦。第二向SDS-PAGE：等电聚焦后的胶条于平衡缓冲液I、平衡缓冲液Ⅱ中先后平衡15 min。平衡后的IPG胶条转移至聚丙烯酰胺凝胶上，与之紧密接触，并用低熔点琼脂糖进行封胶。起始电压为50 V，胶条之下电压加大到120 V。凝胶固定30 min，染色12 h，脱色液脱色2 h。凝胶用UNAX Power look 2100XL-USB 彩色扫描仪进行扫描，并用PDQuest软件进行分析。

1.2.5 胶内酶切与质谱鉴定 从凝胶上选取鉴定的蛋白质点，挖取后转入PCR管中，重复两次脱色20 min（50%乙腈+50 mmol/L碳酸氢铵），脱水10 min（100%乙腈），烘干后的胶在4℃trypsin酶溶液中酶解30 min；37℃烘箱中酶解过夜；50%乙腈+0.1%TFA 60 µL，30 min后将溶液转移至新的96孔板内。样品用4700串联飞行时间质谱仪4700 Proteomica Analyzer进行质谱分析。

1.3 统计分析

测试各指标3次，取其平均值，用 Excel进行折线图绘制。

2 结果

2.1 增强UV-B辐射对小麦叶片的影响

经不同天数的UV-B辐射后，小麦叶片平均长度、总重量、平均叶面积都发生了显著的变化，生长到第3-5天时，B组小麦各指标值均大于CK组小麦，且第4天的差异较大；小麦生长至第6-7天时，B组小麦与CK组小麦各指标值相差甚小；小麦生长至第8-9天CK组小麦各指标值大于B组小麦，且第8天差距较大（图1-图3）。

图1 不同天数UV-B辐射前后小麦叶片平均长度

2.2 增强UV-B辐射对小麦叶片总蛋白含量的影响

根据考马斯亮蓝G-250可与蛋白质相结合的特性测定浓度。以磷酸缓冲液为空白对照，设牛血清蛋白（BSA）不同浓度梯度，用分光光度计测定波长595nm处吸光值；每个样品重复测定3次，根据测定结果，建立了标准曲线方程，绘制出标准牛血清蛋白曲线，用于样品的测定（图4）。

图2 不同天数UV-B辐射前后小麦叶片总重量

图3 不同天数UV-B辐射前后小麦平均叶面积

图4 标准牛血清蛋白曲线

小麦经不同天数的UV-B辐射后，小麦叶片蛋白质含量也发生了显著的变化，随着天数的增加CK组小麦叶片蛋白质含量不断增加，随着天数的增加B组小麦叶片蛋白质含量也不断增加；小麦生长到第3-5天B组小麦叶片蛋白质含量大于CK组小麦，且第4天的差异较大，小麦生长到第6-7天B组小麦与CK组小麦叶片蛋白质含量相差甚小，小麦生长到第8-9天CK组小麦叶片蛋白质含量大于B组小麦，且第8天差距较大（图5）。

图5 不同天数UV-B辐射前后小麦叶片蛋白质含量

2.3 小麦叶片聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

图6-图11所示为第4天、6天、8天，UV-B辐射前后蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳图与其相应的凝胶分析图。生长第4天的小麦CK组光密度小于B组（图6）；生长至第6天的小麦CK组光密度与B组相差甚小，CK组略高于B组（图8）；生长至第8天的小麦CK组光密度与B组差距较大，且CK组光密度大于B组（图9）。

2.4 双向电泳分析

如图12-图15所示，以生长至第4天、8天小麦的正常光照组（CK组）为一组，以第4天、8天小麦的UV-B辐射组（B组）为一组，进行UV-B辐射前后小麦叶片差异蛋白点的分析。如图16，图17所示，本研究中共获取15个差异点：335，429这两个蛋白差异点在CK组中为特异性表达，在B组中并未表达；228，704，671，937及793这5个蛋白差异点在CK组与B组中均有表达，在B组中表达 量 大 于 CK组 ；97，209，416，458，492，633，902及1136这8个蛋白差异点在CK组与B组中均有表达，在B组中表达量低于CK组。

图6 生长至第4天UV-B辐射前后蛋白质SDS-PAGE图

图8 生长至第6天UV-B辐射前后蛋白质SDS-PAGE图

图10 生长至第8天UV-B辐射前后蛋白质SDS-PAGE图

图12 生长至第4天CK组蛋白质双向电泳图谱

图7 生长至第4天蛋白质SDS-PAGE凝胶分析图

图9 生长至第6天蛋白质SDS-PAGE凝胶分析图

图11 生长至第8天蛋白质SDS-PAGE凝胶分析图

图13 生长至第4天B组蛋白质双向电泳图谱

图14 生长至第8天CK组蛋白质双向电泳图谱

图16 CK组蛋白质双向电泳分析图

图15 生长至第8天B组蛋白质双向电泳图谱

图17 B组蛋白质双向电泳分析图

2.5 部分差异蛋白质的质谱鉴定结果

选取UV-B辐射组B组和正常光照组CK组小麦叶片部分差异蛋白，进行胶内酶切，并应用MALDI-TOF-TOF/MS分析，通过MASCOT数据库检索，确定差异蛋白种类和功能。其中成功鉴定了3个蛋白质点（表2）。

表2 差异表达蛋白点的质谱鉴定结果

3 讨论

3.1 叶片指标

叶片是对环境胁迫最敏感的植物器官之一。叶片平均长度、叶片总重量、平均叶面积都是测定小麦生长情况的重要生理指标。经不同天数UV-B辐射后小麦平均叶片长度、叶片总重量、平均叶面积都发生的显著的变化。本试验中小麦的叶片长度受到UV-B辐射后增长速度呈下降趋势，这是因为UV-B辐射会增加乙烯的水平，从而减少伸长生长，这在葵花研究中已经得到证实［10］。Barnes等［11］研究表明，增强的UV-B辐射能破坏植物生长素，即增强的UV-B辐射够通过改变植物的激素代谢水平，从而抑制植物的生长。Li等［12］研究发现，增强的UV-B辐射会降低小麦不同生育期叶面积指数，本试验中小麦平均叶面积在增强UV-B辐射之后整体也出现了减小的变化，说明增强的UV-B辐射对小麦的叶面积产生一定的影响。孙林等［13，14］在研究增强UV-B辐射对冬小麦生长发育及产量的影响中表明，小麦产量在受到增强的UV-B辐射后会减少，UV-B辐射每增加10%，小麦产量降低24.3%。本试验中经UV-B辐射后的小麦相对于正常光照组的小麦总重量降低。这可能与增强的UV-B辐射会破坏植物光合系统有关［15］，也可能与UV-B辐射后植株矮化、叶面积减少综合导致植物生物量减少有关。

3.2 叶片蛋白

蛋白质是构成生物有机体的一个重要组成部分，而且是一种很好的生物催化剂，其在各种生物生理功能方面起着重要作用。蛋白质分子作为UV-B辐射最为敏感的靶分子，UV-B辐射可对其作多种修饰，包括色氨酸的光降解、-SH基的修饰、提高膜蛋白在水中的溶解度、促进多肽链的断裂等［16］。这些修饰可以引起酶的失活和蛋白质的改变［17，18］。而且蛋白质的最大吸收波长正好在辐射（UV-B）的波长范围（280-320 nm）内，因此增强的UV-B辐射会对蛋白质产生较大影响。本研究中增强UV-B辐射使小麦叶片中总蛋白含量增加速度减慢，增强UV-B辐射使小麦蛋白质分解代谢加强，这可能与增强UV-B辐射造成蛋白质结构改变有关，表明蛋白质含量的减少是由于UV-B辐射抑制了蛋白的合成，短时间的UV-B辐射会促进蛋白质的合成，而长时间的 UV-B则会抑制蛋白质的合成，加速分解。

钙是高等植物中普遍存在的一种信号转导分子，一些非生物刺激（如光照、冷、热、缺氧、运动、干旱等）和生物刺激（如植物激素、抗原刺激等）所引起的生理生化反应都被证明与Ca2+信号转导有关。本研究结果中分析出CaM在B组中上调表达，推断增强的UV-B辐射引起了钙浓度的变化，激发一系列信号转导过程，进而引起一系列的反应。崔洪宇等［19］的研究表明，不同刺激引发的钙信号可以引起不同的生理反应，以应答不同的外界刺激，提高植物体适应逆境胁迫的能力。

Rubisco在B组的表达量低于CK组，初步推断，增强的UV-B辐射作为一种信号分子可能通过信号相关蛋白，引起一系列的反应，包括抑制Rubisco的活性，这与Allen等［20，21］的研究一致，增强的UV-B辐射抑制Rubisco活性，使其大小亚基及全酶的活性降低。

4 结论

UV-B辐射通过作用于小麦幼苗叶片中相关蛋白的信号传导与转录、胁迫防御的能量代谢等调节小麦生长。

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