牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定

崔新洁 王婷 刘秉春 陶林 王潇

（内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010010）

在奶牛乳腺炎的发病过程中，乳腺上皮细胞是与外界直接相通的细胞，乳腺上皮细胞上含有模式识别受体TLR，对机体的先天性免疫具有重要的作用。除此之外，乳腺上皮细胞最重要的功能是泌乳。因此建立简便、经济、纯净的乳腺上皮细胞的体外培养模型，对病原免疫学以及泌乳机制的研究都具有重要的意义。1961年，Ebner等［1］第一次将乳腺上皮细胞在体外培养至30-40代，但是，随着传代次数的增加，大多数上皮细胞失去原有的特性，而表现成纤维细胞的特性。之后多种方法被采用，以去除成纤维细胞的污染，如在培养液中添加D-缬氨酸以选择性地去除成纤维细胞，或密度梯度离心法，或胶原酶与胰酶共同消化法等［2-10］，但随着传代的进行，都不同程度地混有成纤维细胞的污染。乳汁是由乳腺上皮细胞分泌的，在分泌乳汁的过程中，会有很多乳腺上皮细胞自然脱落，随乳汁分泌到体外，因此从乳汁中可以分离培养乳腺上皮细胞，同时，分离到的细胞中不含有成纤维细胞的污染，克服了组织块消化法的缺点，另外，该种方法无需使用昂贵的胶原酶，较组织块消化法更为经济。国外研究人员已利用该法成功培养出了乳腺上皮细胞［11，12］，主要是通过离心新鲜牛奶收集牛奶中细胞的方法来培养乳腺上皮细胞，目前在国内报道中，通过乳汁分离法获得乳腺上皮细胞的不多，只有崔立莉［13］成功从牛奶中分离培养了乳腺上皮细胞。牛乳腺上皮细胞是高度分化的细胞，在体外培养时培养基的成分是培养成功的关键。早期的研究者已经证实激素对乳腺上皮细胞的生长是有利的，Turkington［14］研究发现牛胰岛素、氢化考的松、催乳素等激素的相互作用会促进乳腺细胞中RNA的生物合成；另外，Turkington还发现EGF，即上皮细胞生长因子可以促进乳腺上皮细胞中DNA的合成及随后的细胞分裂［15］。因此，在培养细胞的过程中，通常将激素、EGF和谷氨酸作为上皮细胞培养基中主要的成分［16-19］。综合前人的研究，本研究采用新鲜牛奶作为试验材料，拟建立一种较成熟、简单的乳腺上皮细胞的体外培养方法，旨在为体外试验的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2011年7月至12月，在内蒙古大学完成。新鲜牛奶取自内蒙古呼和浩特市小黑河镇二道河村奶农饲养的日产奶量25-40 kg的高产荷斯坦奶牛。

试验过程中使用的仪器包括超净工作台、离心机、CO2培养箱、荧光倒置显微镜、普通光学显微镜以及PCR仪等。完全培养液成分是10% FBS+DMEM/F12+100 U双抗+氢化考的松（1 µg/mL）+孕酮（1 µg/mL）+转铁蛋白（5 µg/mL）+胰岛素（5µg/mL）+200 mmol L-谷氨酰胺+10 ng/mL EGF；其中FBS和DMEM/F-12购自Hyclone公司，EGF购自北京索莱宝生物技术有限公司，其余添加因子购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 乳汁中分离培养细胞 用无菌水清洗牛乳房，酒精消毒，手挤牛乳于灭菌的蓝盖瓶中，放于盛有37℃水的保温盒中带回实验室。将200 mL乳汁与含双抗的PBS按2∶1混合后，转入15 mL离心管中，1 500 r/min，离心20 min，离心后分3层，弃掉乳脂层及大部分乳白色浑浊层至剩余1 mL左右，混合所有离心管中剩余的液体（切勿吸取底层白色沉淀）于一离心管中，再次离心15 min后，小心弃掉上层乳白色液体后，剩余0.5 mL细胞层，将剩余细胞层转移到5 mL完全培养液中（切勿吸取底层白色沉淀），接种于25 cm2细胞培养瓶中，5%CO2箱中培养，每隔2 d换液，待细胞长出单克隆后原瓶消化，待长至80%汇集时，传代培养（1传3），多次传代后冻存。

1.2.2 MTT法测定细胞生长曲线 细胞复苏，用台盼蓝染色确定浓度，接种于96孔细胞培养板。细胞接种浓度为4×103个/孔，设置对照组和试验组，每组3个重复，37℃、5%CO2培养箱中培养1、2、3、4、5、6、7 d后于同一时间吸出孔内培养液，分别加入MTT使用液（100 µL孔，浓度0.5 mg/mL），继续培养4 h，加入DMSO液（150 µL/孔），37℃下培养箱中孵育10 min，不断震荡使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD570nm值。记录结果，绘制细胞活力曲线图。

1.2.3 RT-PCR检测角蛋白8、18及β-酪蛋白 细胞复苏，生长到80%汇合时，胰酶消化，收集细胞，用总RNA提取试剂盒（TaKaRa；D9108A）抽提细胞总RNA。为排除基因组DNA的污染，用DNA酶（TaKaRa；00079459）消化处理后，用反转录试剂盒（TaKaRa；BK3702）反转录，用PCR反应试剂盒（TaKaRa；DR100A）进行扩增反应，电泳检测扩增产物。退火温度分别是角蛋白8：62℃；角蛋白18：62℃；β-酪蛋白：62℃ 。

根据NCBI上公布的牛基因序列设计引物如表1所示。

1.2.4 细胞免疫荧光染色法鉴定角蛋白8 细胞复苏，于常温下用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3 次，每次5 min；加入0.2%的TritonX-100通透处理5 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入10%正常山羊血清封闭处理30 min；加一抗（空白对照试验用PBS代替）于37℃下振荡孵育1 h，一抗为兔抗人的细胞角蛋白8多克隆抗体（1∶100稀释），PBS清洗3次，每次5 min；加入1∶50稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG 的二抗，室温下避光振荡孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入DAPI使用液（10 μg/mL），室温避光孵育10 min，荧光显微镜下观察结果。

表1 本研究所设计的引物序列

1.2.5 染色体中期分裂相制备与组型分析 细胞生长至70%-80%汇合，加入秋水仙素（终浓度0.1µg/mL），在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中作用 3 h；0.25%胰酶消化使细胞脱壁，将细胞悬液装入15 mL 离心管，1 500 r/min离心5 min，去上清；缓缓加入37℃预热的0.075 mol/L KCl 5 mL，37℃条件下孵育30 min；加入1 mL新鲜配制固定液（甲醇∶冰乙酸 = 3∶1）预固定3 min，1 500 r/min离心5 min，去上清；加入新鲜固定液6 mL，轻轻吹打均匀，室温固定30 min，500 r/min离心5 min去上清，重复固定细胞2遍；末次离心后，小心吸除大部分上清液，余下0.5 mL固定液，轻轻吹打重悬细胞并混匀；胶头滴管吸少量细胞悬液，滴落在-20℃预冷过的洁净载玻片上，迅速在酒精灯火焰上烤干；制备好的染色体标本用Giemsa染色液浸染10 min，流水冲洗3次，自然干燥后，于显微镜下观察，并进行组型分析。

2 结果

2.1 牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养

接种3 d后，均可见许多鹅卵石样细胞聚集生长形成的克隆，如图1-A，以及分散生长的梭形的单个细胞，如图1-B，同时还可见少量的吞噬细胞（图1-A，图1-B中标记出的细胞）；每3 d换液，继续培养9 d后，形成许多大的、生长均匀的单细胞克隆，有鹅卵石和多角形状两种，如图1-C和1-D；在细胞克隆的表面有分泌到胞外的乳滴，如图1-E；同时发现吞噬细胞大多转移到乳滴中，如图1-F；原瓶消化使细胞分散，继续培养2 d后，细胞在瓶底80%汇集，吞噬细胞消失，形成均匀的多角形和鹅卵石状细胞混合生长的乳腺上皮细胞层，如图1-G，形状也分鹅卵石和多角形两种。细胞传代后冻存，复苏后存活率高达90%，如图1-H。

图1 细胞培养图片

2.2 MTT法测定细胞生长曲线

牛乳腺上皮细胞生长曲线如图2所示，牛乳腺上皮细胞接种后前2 d生长相对缓慢，之后3 d进入快速生长的对数期，最后细胞生长缓慢，活性降低。结果表明，培养的牛乳腺上皮细胞具有正常的分裂增殖特性。

图2 牛乳腺上皮细胞生长曲线

2.3 RT-PCR检测角蛋白8、18以及β-酪蛋白

角蛋白8、18是乳腺上皮细胞的特异性蛋白，牛的细胞角蛋白8和18基因没有内含子结构，提取的细胞总RNA中含有少量的基因组DNA污染，因此，在进行反转录之前，用DNA酶对RNA进行消化处理，以去除DNA污染的RNA为模板。将角蛋白8作为阳性对照，以提取RNA以及消化后的RNA为模板进行PCR反应以确定基因组DNA被彻底降解，如图3-A，用此彻底消化的RNA为模板进行反转录合成cDNA的第一链并用以合成的角蛋白8、18的引物进行PCR反应，得到了单一的目的条带如图3-B和3-C。结果表明，乳汁分离法体外培养的乳腺上皮细胞在mRNA水平上表达细胞角蛋白8和18，具有上皮细胞特性。

酪蛋白是乳汁中含有的一种主要的蛋白，β-酪蛋白是其中一种。培养细胞所用的培养基中胰岛素、孕酮以及氢化可的松的添加会刺激细胞分泌乳汁。提取细胞总RNA，反转录后用所设计的β-酪蛋白的引物进行PCR扩增反应得到了目的条带，如图3-D，证明所培养的细胞具有正常的泌乳功能。

2.4 细胞免疫组化的方法鉴定角蛋白8

图3 PCR结果

用细胞免疫组化的方法分析了分离培养的乳腺上皮细胞的骨架蛋白-细胞角蛋白8的表达情况，?结果分离培养的乳腺上皮细胞呈阳性，如图4-A和4-B；而空白对照，即一抗用PBS替代其他处理条件相同的细胞为阴性，如图4-C和4-D，进一步在蛋白水平上证明分离培养的细胞是乳腺上皮来源。

图4 免疫组化鉴定角蛋白8

2.5 染色体中期分裂相制备与组型分析

选择分散良好、轮廓清晰的视野进行分析（图5-A），并进行组型排列，结果（图5-B）显示有60条染色体，共30对，29对常染色体为端着丝粒染色体，一对性染色体是进端着丝粒染色体，与乳牛染色体组型一致，证明所养细胞来源于乳牛。

图5 核型分析结果

3 讨论

3.1 牛乳腺上皮细胞的培养

牛乳腺上皮细胞在宿主的先天性免疫中起重要作用，因此，建立一个完善的牛乳腺上皮细胞体外培养模型，将有助于在体外研究乳房炎的机理。目前，被广泛使用的方法为胶原酶消化法，但是胶原酶的消化不具有特异性，而牛乳腺组织中不仅含有乳腺上皮细胞还有大量的成纤维细胞和脂肪细胞，因此，胶原酶消化下来的细胞类型多样，培养后贴壁的细胞主要是乳腺上皮细胞和成纤维细胞，成纤维细胞的生长能力很强，在培养过程中很难去除，但是两种细胞对胰酶/EDTA的敏感性不同，成纤维细胞比乳腺上皮细胞容易被胰酶消化，因此主要采用胰酶消化法去除成纤维细胞，但是纯化不彻底［20］。

乳腺上皮细胞是高度分化的细胞，若在体外培养，环境因素的影响很容易导致其脱分化，发生基因突变与缺失等，因此，体外培养过程中要不断摸索其生长条件，添加各种生长因子，以维持其分化状态。参考前人［11，12，21-23］对培养液中各因子的添加情况，本试验采用的完全生长液配方，在该种培养液成分中细胞生长状态良好。

腺泡是乳汁分泌的最小的结构单位，由泌乳上皮细胞，导管上皮细胞以及肌上皮细胞等构成的。乳汁是由乳腺上皮细胞分泌的，在分泌乳汁的过程中，会有很多乳腺上皮细胞自然脱落，随乳汁分泌到体外，因此可以从乳汁中可以分离培养乳腺上皮细胞［24］。许多研究人员从常乳中不能分离培养乳腺上皮细胞，通过我们的研究，认为取材是关键的一步，首先，奶牛要选择产奶量较高者；其次，在取奶是要注意无菌操作；其三，所取牛奶一定要注意保温，冷却的牛奶中细胞的活性很低，很难培养出乳腺上皮细胞；其四，也是最重要的一点，离心后弃掉上层浊液的过程一定要用枪头缓慢吸弃，不可将枪头插到液面以下，以防吸走分离的细胞。我们选取产后2-4个月的日产量25-40 kg的荷斯坦奶牛的新鲜牛奶为材料，并成功培养，说明常乳也可用于乳腺上皮细胞的培养。较昂贵的胶原酶消化法来说，乳汁分离法取材方便、操作简单、培养周期短、细胞较为纯净，是一个乳腺上皮细胞培养的有效方法。该种方法分离到的细胞中除了上皮细胞外，还含有吞噬细胞，具有吞噬自身以外杂质的能力，首先就使得培养的过程中污染的几率减小，同时吞噬细胞增殖性较小，而且吞噬了杂质的吞噬细胞会自发死亡，传代之后吞噬细胞基本消失，有利于得到纯净的上皮细胞。

试验中发现原代培养的过程中，吞噬细胞会向分泌到胞外的乳滴中转移，有报道［25-27］说乳汁中的乳铁蛋白的存在能帮助机体更好地抵御金黄色葡萄球菌等主要乳房炎病原菌的侵害，这一现象或许可以作为一个体外研究乳汁与病原菌作用的模型。

3.2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定

乳腺上皮细胞的鉴定是通过鉴别细胞的特异性标志物，其中细胞骨架如角蛋白，是乳腺上皮细胞重要的标志蛋白。本研究对腺上皮角蛋白8、18进行了RNA水平上的鉴定，并在蛋白水平上对角蛋白18用细胞免疫组化的方法进行鉴定，证明了所培养的细胞具有腺上皮属性。另外，乳蛋白是乳汁的重要组成成分，在培养基中添加孕酮、胰岛素以及氢化考的松等激素能够诱导乳蛋白的表达。酪蛋白是一种主要的乳蛋白，对酪蛋白在RNA水平上的鉴定以及显微观察细胞生成乳滴等证明了所培养的细胞是能够产生乳汁的上皮细胞即乳腺上皮细胞类型。由于角蛋白和酪蛋白只由一个外显子构成，因此提取的RNA要经过DNA酶的消化，以防止基因组 DNA 的污染［20］。

通过对所培养的细胞增值的MTT法测定证明所培养的细胞具有正常的分裂增生能力。通过核型分析试验证明所培养细胞是乳牛来源。通过对所培养的细胞进行鉴定，证明所培养的细胞是牛源的具有正常分裂增生能力以及泌乳功能的乳腺上皮细胞。

4 结论

本研究建立了乳汁分离法体外培养牛乳腺上皮细胞的模型，认为只要取材合适，200 mL牛乳即可用于原代培养乳腺上皮细胞。为乳腺上皮细胞的体外培养研究提供了思路，建立了简便、经济、纯净的乳腺上皮细胞的原代培养方法。

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