美洲黑杨与大青杨杂种无性系分子鉴定

江锡兵 张志毅 龚榜初

（1. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所，富阳 311400；2. 北京林业大学林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点实验室，北京 100083）

经典的植物学分类方法是形态鉴定方法，由于表型性状易受环境条件的影响，亲缘关系相近的物种之间在形态上差异性较小，利用表型性状鉴定有时会造成品种鉴定的准确性不够，因而很难完整而正确地揭示一些物种之间的亲缘关系。分子生物学的迅猛发展及实验技术的突破，使人们可以在基因组水平上对生物进行指纹分析，进而形成了分子分类技术［1］。利用现代分子标记技术进行分类和鉴定可以从本质上为植物分类和鉴定提供依据，同时可以鉴别形态分类的准确性。

杨树作为重要经济栽培树种，育种学家选育出了大量的优良无性系在世界范围内广泛交流应用，然而，仅仅利用形态鉴定优良无性系之间的差别存在着极大的局限性，因此，构建指纹图谱进行无性系鉴定和良种登记显得尤为重要。指纹图谱鉴别无性系具有准确迅速等优点，意大利的Castiglione［2］利用RAPD 标记技术构建了32个杨树无性系的指纹图谱，结果表明利用这一技术可以有效区分那些形态学上无法鉴别的无性系。尹佟明等［3］利用AFLP标记技术对42个美洲黑杨无性系进行了指纹分析，发现根据每一无性系的特征谱带组合可以鉴别不同的无性系。

本研究以美洲黑杨与大青杨12个杂种无性系为材料，其中7个在生长量或抗寒性方面表现优良［4］，采用AFLP 标记技术从分子水平上对无性系进行鉴别，构建其指纹图谱，旨在为杨树杂种无性系鉴定以及新品种审定、保护奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用材料为李善文［5］通过人工杂交获得的12 个美洲黑杨与大青杨杂种无性系，12 个无性系获得于3 个杂交组合，无性系编号及其杂交组合父母本来源，如表1所示。

表1 杂种无性系编号及其父母本来源

1.2 方法

1.2.1 样品DNA提取纯化 取12 个杂种无性系材料的新鲜叶片各5 g，标号，在液氮中迅速研磨成粉末，采用天根生化科技（北京）有限公司提供的植物基因组DNA 提取试剂盒（操作方法见说明书）提取12 份材料的基因组DNA，风干后溶于TE 缓冲液；用RNA 酶进行纯化处理后在1% 琼脂糖凝胶上进行电泳，并测定样品DNA 浓度，根据测定结果，将所有样品DNA 稀释至相应浓度，-20℃ 保存备用。

1.2.2 酶切和接头连接 采用内切酶EcoR I和MseI对DNA 样品进行双酶切，并加入EcoR I接头和MseI接头的混合物对酶切产物进行连接，酶切连接反应体系参照李博方法［5］，37℃ 恒温酶切连接≧ 4 h。

1.2.3 预扩增 将酶切连接产物稀释若干倍作为预扩增模板，预扩增采用E00+ M00的引物组合（表1），引物合成于上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen），反应体系参照李博方法［6］。PCR扩增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环；72℃ 5 min，4℃ forever。预扩增完成后，取5 µL预扩增产物加水95 µL，稀释20倍，置于4℃ 备用，其余预扩增产物在-20℃ 下保存，备用。

1.2.4 选择性扩增 以稀释后的预扩增产物为模板进行选择性扩增，选择性扩增采用EcoR I+3/MSeI+2的引物组合，引物同样合成于上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen），反应体系参照李博方法［6］。PCR扩增程序：94℃ 3 min；（94℃ 30 s，65℃ 30 s（-0.7℃ / cycle），72℃ 1 min，13 个循环 ；94 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环；72℃ 5 min，4℃forever。选择性扩增后的产物在4 ℃下保存，备用。

表2 AFLP分子标记引物信息

1.2.5 电泳及银染 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染程序参照李博方法［6］。

1.2.6 统计分析 统计AFLP 扩增条带，清晰易于辨认的条带记录为“1”，空缺时记录为“0”。应用Nei 等［7］方法计算遗传相似系数Gs= 2Nij/（Ni+Nj），其中Ni、Nj、Nij分别表示第i个材料的扩增条带数、第j个材料的扩增条带数、第i和第j个材料扩增的共有条带数；利用NTSYS-pc 2.1 软件按照UPGMA 方法进行聚类分析，绘制聚类图［8］；选取清晰的AFLP 条带绘制12个杂种无性系的指纹图谱。

2 结果

2.1 引物筛选

采用EcoR I+3/MseI+2 的引物组合，从32对引物组合中筛选出10 对扩增条带较多的引物组合对无性系材料进行选择性扩增。筛选出的10 对引物组合的扩增产物经聚丙烯酰胺电泳后得到总条带数在7-52 条之间，多态性条带数在2-28 条之间，条带多态性比例分布范围为23.5%-41.6%（表3，图1）。平均条带数最多的引物组合是E51-CTA / M44-TC，共得到52 条。平均条带数最少的引物组合为E51-CTA / M38-CT，仅有7 条。多态性条带数最多的引物组合为E40-ATC / M33-AG，共28 条。多态性条带数最少的引物组合为E51-CTA / M38-CT，仅有2条。在所有引物组合中，E51-CTA / M42-GT扩增所得条带多态性比例最低，仅为23.5%，而E63-GAA /M33-AG扩增所得条带多态性比例最高，为41.6%。

表3 不同引物组合的AFLP 条带统计

2.2 聚类分析

在所有扩增条带中，选取83 条AFLP 多态性条带，用NTSYS-pc 2.1 软件按照UPGMA 方法进行聚类分析，绘制了12 份美洲黑杨与大青杨杂种优良无性系的亲缘关系树状图（图2）。从聚类图中可以看出12 个无性系可以分为3 组，其中136-163 聚为一组，181、183聚为一组，190-193 聚为一组。136、141、146、147、153和163等6 个杂种无性系是美洲黑杨I-69 与大青杨3 号杂交的全同胞子代，具有较近的亲缘关系。聚类结果显示该组合内又分为3组，其中，136 和153，146、147和163在相似系数0.82水平上各自聚成一组，然后两组在0.79 水平上聚为一组。而141 单独聚为一组，与其它个体在0.74水平上聚为一类。无性系181 和183 是大青杨4 号与美洲黑杨T66 的杂交子代，而无性系190、191、192、193 则是大青杨4 号与美洲黑杨T26 的杂交子代。两组由于具有共同的母本，在聚类图上显示在0.65 水平聚为一起。两组个体具有相同的母本，但是聚类结果显示亲缘关系相对全同胞杂交子代较远，说明父本的差异对它们的亲缘关系具有一定的影响。

图1 AFLP选择性扩增结果

2.3 遗传相似系数分析

图2 基于AFLP 数据的12个杂种无性系聚类图

根据10 对引物组合选择性扩增产物的电泳结果，分析12 个美洲黑杨与大青杨杂种的遗传相似系数（表4）。12 份材料由3个杂交组合的子代构成，美洲黑杨I-69 与大青杨3 号杂交子代包括无性系136、141、146、147、153和163，这6 个无性系间遗传相似系数变化范围在0.673 0-0.826 9 之间，平均为0.784 5。大青杨4 号与美洲黑杨T66杂交子代181与183遗传相似系数为0.807 6。大青杨4 号与美洲黑杨T26 的杂交子代为190、191、192、193，这4个子代间遗传相似系数变化在0.711 5-0.884 6之间，平均0.804 5。3 个组合间，I-69与大青杨3号杂交组合内个体平均相似系数最低，暗示该组合可能相对于其它杂交组合具有更丰富的遗传变异。在所有个体间，相似系数最小的是183 与153，为0.173 0，相似系数最大的是191 与192，为0.884 6。在以大青杨4 号为母本的2 个组合中，183 与190、192的相似系数最低为0.557 6。这可能是由于不同父本基因组差异造成的。

表4 12个杂种无性系遗传相似系数

2.4 指纹图谱构建

根据选择性扩增结果，选择6 对引物扩增出的9 条多态性条带绘制了12 个美洲黑杨与大青杨杂种的指纹图谱（图3）。6 对引物组合分别为E40-M33、E51-M38、E51-M40、E51-M44、E51-M56、E60-M34。从图中可以看出，在该图谱中每份材料都具有独特的带型，从而可以与其他材料互相区分。

图3 12个杂种无性系AFLP指纹图谱

3 讨论

利用分子标记构建指纹图谱用于鉴别无性系与传统的表型鉴定方法相比，具有不受环境干扰、快速准确等优势。胡晓丽等［9］对12 个三倍体毛白杨和二倍体毛白杨无性系进行AFLP 分子标记鉴定，采用EcoR I + 2 /MseI + 3 引物组合，不同引物组合扩增结果的多态性比例分布范围为15.7%-32.4%。本研究采用EcoR I + 3 /MseI + 2 的引物组合，从32对引物组合中筛选出10 对扩增条带较多的引物组合进行选择性扩增。多态性比例最高的引物组合是E63-GAA / M33-AG，为41.6%。多态性比例最低的引物组合是E51-CTA / M42-GT，为23.5%。本研究结果显示，引物扩增多态性比例相比胡晓丽等人的研究结果较高，可能是由于扩增引物选择性碱基数不同造成的，也可能是本研究选择的杂交亲本具有相对较远的亲缘关系造成的。

聚类分析结果显示所有供试个体被聚为3组，聚类结果与其系谱关系完全一致。大青杨4 号作为母本分别与美洲黑杨T66 以及T26 进行杂交，第一个杂交组合包括无性系181 和183，后者包括190、191、192、193 等4 个无性系。聚类图显示两组杂交子代在0.65水平聚为一类，表明两组个体虽然具有相同的母本，但是聚类结果显示亲缘关系相对全同胞杂交子代较远，说明父本的差异对它们的亲缘关系有较大影响。

李宽钰等［10］对黑杨派、白杨派和青杨派DNA多态性的研究结果显示白杨派4 个树种遗传相似系数在0.606 9-0.821 5之间，平均为0.662 7。李善文［4］计算得到白杨派全部样本间平均遗传相似系数是0.8273。本研究计算得到了12 份美洲黑杨与大青杨杂种的遗传相似系数，数据显示相似系数在0.173 0-0.884 6之间，平均0.660 4。相似系数变化范围与先前研究相比较宽，可能是由于供试材料不同造成的。此外，美洲黑杨I-69 与大青杨3 号杂交组合内个体平均相似系数在3个组合中最低。暗示该组合可能相对于其他杂交组合具有更为丰富的遗传变异，有利于下一步选择育种工作的开展。在所有个体间，相似系数最小的是183 与153，仅为0.173 0，相似系数最大的是191 与192，为0.884 6。在以大青杨4 号为母本的两个组合中，183 与190、192 的相似系数最低，为0.557 6，这可能是由于不同父本基因组差异造成的。

RAPD、AFLP、SSR 等众多分子标记技术都被用来构建指纹图谱［2，3，11，12］。RAPD 标记带型丰富，但是重复性较差。SSR 标记重复性好，但是条带不够丰富并且引物开发需要有已知序列，难以推广到基因组信息未知的树种。AFLP 标记技术则具有带型丰富，重复性好，引物开发不依赖已知序列等优点。胡晓丽［9］与本研究分别使用了3 对和6 对引物即可以分别将试验所用无性系材料进行准确区分和鉴定。因此，相对于其它分子标记技术，AFLP 是构建指纹图谱较好的分子标记系统。

4 结论

本研究采用AFLP标记技术对美洲黑杨与大青杨12个杂种无性系进行分子鉴定，10对引物组合扩增得到总条带数在7-52 条之间，多态性条带数在2-28 条之间，条带多态性比例分布范围为23.5%-41.6%；UPGMA 聚类分析将12个无性系在不同水平上聚为3大类，结果与其系谱关系一致；根据6个引物组合的9条多态性条带绘制了12个无性系的指纹图谱。

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