五指山猪与长白猪65 d胎儿组织MRFs家族基因的表达研究

曹 婷，施力光，张立岭，荀文娟，周汉林，黄显州，侯冠彧＊

（1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所／农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南 儋州571737；2.海南大学 农学院，海南 海口570228）

猪肌肉生长发育和产肉性状形成分子机制一直是动物遗传育种领域关注的重点，解析产肉性状形成的分子机制，是有效开发利用地方猪种优良种质特性和培育优良新品种的关键［1］。五指山猪在作为模式动物研究的同时，其优良种质特性，如背肌厚、脂肪含量低、风味氨基酸含量高等作为特色高档肉食品开发意义重大，但是具有生长慢、体型小的缺点［2］。本试验以五指山猪和生长速度较快但肉质稍差的长白猪为研究对象，分析肌生成调控因子MRFs基因家族成员在以上两种猪妊娠期65 d胎儿组织中mRNA表达情况，为探索肌肉生长发育差异机制、系统选育及控制体型大小提供参考［3-4］。

肌生成调控因子MRFs基因家族在动物肌肉形成和发育过程中起着至关重要的调节作用。MRFs基因家族成员包括Myo D 1、Myf4、Myf5和Myf6四种基因，其中Myo D1和Myf5最先表达，主要负责调控肌细胞的增值和调节生肌细胞系的定向作用，随后Myf4和Myf6基因进一步完成肌纤维的形成，它们的缺失可以直接或者间接导致肉品质和产肉量的降低［5-7］。因此，对MRFs基因家族成员在不同组织表达量的研究，可以为进一步提高肉品质和肉产量提供一定理论依据，同时为进一步深入研究影响五指山猪或其他动物生长发育和体型大小机制提供借鉴［3-4］。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物为中国热带农业科学院实验猪场妊娠期65 d五指山猪和长白猪各一头，快速处死，将胎盘取出，分别采集2个胎儿不同组织，放于液氮，备用。

1.2 试剂及仪器

主要试剂RNAiso Plus总RNA提取试剂、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒（SYBR®Premix Ex Taq TM）均购自大连宝生物工程有限公司；主要仪器：核酸浓度测定仪（Nano Vue，美国GE），PCR仪（Biometra），凝胶成像系统，小型台式冷冻离心机（德国Eppendorf）、荧光定量PCR仪（德国Eppendorf），SA-960-2超净工作台（上海上净净化设备有限公司），移液枪（physiocare），荧光定量PCR八联管套装（Axygen）。

1.3 qPCR

1.3.1 总RNA提取和反转录 按试剂盒说明提取各组织总RNA，核酸紫外分光光度计检测浓度及纯度，稀释备用。

反转录：Total RNA 0.5μL；Prime Script TM RT Enzyme MixⅠ0.5μL；5×prime Script TM Buffer终浓度1×；Random 6 mers终浓度50 pmol；Oligo d T Primer终浓度 25 pmol；RNase Free d H2O Up to 10μL。37℃，15 min；85℃，5 s。放于-20℃冰箱待用。

1.3.2 引物 Primer5设计引物，上海生工生物合成，见表1。

表1 RT-PCR引物信息Table 1 Real time RT-PCR primer information

1.3.3 qPCR 试 验 采 用 realplex4qPCR 仪，SYBR Green I染料二步法，25μL反应体系：SYBR®Premix Ex Taq TM 12.5μL，引物1μL（10 μmol／L），c DNA模板2μL，dd H2O 9.5μL。预热95℃60 s，变性95.0℃10 s；退火61℃20 s；循环40次。

1.4 统计数据

参考 Winer等的方法［8］，在保证以上四种基因扩增效率的前提下，分别以各个基因在五指山猪胎儿腿部骨骼肌中的表达水平为标准量，2-△△Ct法结合内参基因运算目的基因相对mRNA表达情况（每个基因都有个Ct值，即荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数；△Ct＝目的基因的Ct-内参基因的Ct；△△Ct＝标准量的△Ct与其他△Ct的差；相对表达量则为2-△△Ct）。SAS软件数据分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

MRFs基因家族成员在五指山猪与长白猪65 d妊娠期胎儿各组织中m RNA相对表达情况分析结果见图1～4。

试验结果表明，MRFs家族成员除在肝、肾、肠组织以外，在五指山猪65 d胎儿组织中mRNA表达水平均高于长白猪65 d胎儿相应组织中的表达水平（P＜0.05）；mRNA表达水平在腿肌和背肌中的表达普遍偏高，其他组织中表达较低（P＜0.05）；2个猪种在以上10种组织中MRFs家族mRNA表达水平高低分布基本一致，在腿部和背部骨骼肌及肝脏、肺和胃组织MRFs基因家族mRNA表达量较高，肾、肠和心脏中的表达量较低，相对表达量高低顺序为：腿部骨骼肌＞背部骨骼肌＞肝＞肺＞胃＞脾＞脑＞肾＞肠＞心。

图1 Myo D1基因在五指山猪和长白猪65 d妊娠期胎儿各组织中mRNA相对表达水平Fig.1 MyfoD1 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

图2 Myf4基因在五指山猪和长白猪65 d妊娠期胎儿各组织中mRNA相对表达水平Fig.2 Myf4 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

图3 Myf5基因在五指山猪和长白猪65 d妊娠期胎儿各组织中mRNA相对表达水平Fig.3 Myf5 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

图4 Myf6基因在五指山猪和长白猪65 d妊娠期胎儿各组织中mRNA相对表达水平Fig.4 Myf6 mRNA levels in different tissues of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days

3 讨 论

目前，中国是世界上最大的养猪和猪肉产品消费国。随着人们生活水平的不断提高，对猪肉的要求也日益增大，猪的生长速度和瘦肉率的提升也越显重要，但目的性的选育难免会降低其他相关肉品质，所以越来越多的肉品质优化问题日益显著起来［9］。五指山猪原产于海南，具有遗传稳定、抗逆性强、背肌厚、膘少、代谢率低、氨基酸组成丰富等诸多特点［3-4］，但缺点是体形矮小、生长缓慢［2］。长白猪原产于丹麦，具生长速度快、体型大、屠宰率高等优点［3-4］，缺点是肉质欠佳［10］。不同品种的猪各具优缺点，如何结合相应优点培育出满足消费者要求的品种是改善和提升肉品质的关键。本试验通过荧光定量等方法比较和分析五指山猪和长白猪妊娠65 d胎儿腿部、背部骨骼肌及各内脏器官组织中控制肌肉生成和发育的MRFs基因家族的mRMA的表达差异，结果显示除肝、肾和肠以外，MRFs基因家族m RMA的表达在五指山猪胎儿组织中普遍高于长白猪胎儿组织中的表达，且两种猪肌肉组织中的表达差异明显。因此，导致五指山猪和长白猪肉品质和生长速度及体型的差异很可能与MRFs基因家族表达的差异有直接关系。对日后深入研究控制肌肉生长、发育机理和肉质性状发育，以及为控制猪种体型大小的形成机理提供理论依据。

肉品质性状的表现很复杂，受遗传及环境影响。遗传因素表现在动物出生前骨骼肌的形成，由肌纤维构成，形成过程在妊娠期70 d左右完成，出生后只增大肌纤维体积，数量并不增加［2-4，11］。肌肉的形成和日后的生长主要由MRFs基因家族成员调控［3-6］。MRFs基因家族分为两类，一类是先表达的Myo D1和Myf5基因，称为初级MRFs，表达在成肌细胞增殖过程中，在生肌细胞系的定向中起调节作用；一类是 MyoG 及Myf6基因，称为次级MRFs，对肌纤维的形成具有进一步完成作用［3-5，7］。在胚胎发过程中，Myf5是肌细胞中最先被诱导表达的基因，接下来表达的是 Myo D1、Myf5与Myo D1，它们之间有互补代偿作用，两种基因同时缺失会导致分化和形成的骨骼肌和成肌细胞不出现。由此可见，Myf5与MyoD1基因在肌肉形成上的重要作用［3-4，11-12］。Myf4是唯一在骨骼肌细胞系中都能表达的MRFs成员，在肌细胞分化中的正调控作用不可替代，调控肌细胞融合的起始，促进肌细胞的增殖，进一步使单核成肌细胞转变为多核肌纤维，决定骨骼肌特异表型，并影响产肉量和肉品质［3，4，13-18］。Myf4 的位点突变会影响氨基酸序列、功能或改变该基因在胚胎发育时期的表达方式及水平，直接影响产肉量［3，4，19-22］。Myf6的作用及机理更加复杂，它的激活主要存在于动物出生后，具有促进次级肌纤维形成的调节作用，并在肌肉表型维持和肌纤维形成起着重要作用，是唯一能存在于成熟神经节中的MRFs成员。Myf6基因与MyoG基因有很大的同源性，共同控制肌肉的分化。在肌肉的分化过程中这两个基因几乎同时表达，Myf6的自身突变能影响Myf5的表达，可以间接影响肌肉的产量［3-4，23］。本研究结果显示，无论在五指山猪胎儿还是在长白猪胎儿组织中，都是在骨骼肌中MRFs基因家族的mRNA的表达水平最高，且明显高于其他组织，说明该基因家族在肌肉的发育行程中起到了重要的正向调节作用；MRFs基因家族的基因在五指山猪胎儿肌肉中的mRNA表达普遍高于在长白猪胎儿骨骼肌中的表达，表明不同猪种间肌肉发育的差异与MRFs基因家族的表达水平的差异可能有直接联系。这些结果有可能体现MRFs基因家族在肌肉组织生成和发展的关键作用的依据，以及为MRFs的表达水平导致肉质性状不同提供参考。因此，研究MRFs基因家族成员的作用机理和互作关系为日后进一步了解肌肉和其他组织的生长发育和变化规律提供一定的参考。

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