正常与乳腺肿瘤细胞表面黏附分子CD44活化状态差异分析

侯利丹，刘鹥雯，何怡青，杨翠霞，杜 艳，高 锋

(上海交通大学附属第六人民医院中心实验室，上海200233)

CD44是一种广泛分布于细胞表面的跨膜糖蛋白受体［1-2］。其配体透明质酸(HA)是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的高分子黏多糖，是细胞外基质的主要组成部分。据报道，CD44与HA结合，可介导细胞与细胞外基质黏附、淋巴细胞归巢等多种生理和病理过程［3-4］。许多肿瘤细胞表面CD44高度表达，其在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用。目前，已有许多学者以CD44为靶点分子，通过阻断CD44-HA结合从而降低肿瘤转移，进行肿瘤的靶向治疗。Zawadzki等［5］运用 CD44s受体蛋白、CD44v10受体蛋白和CD44单克隆抗体阻断小鼠B16F10黑色素瘤CD44与其配体HA结合，发现在不进行任何其他处理的情况下，CD44s受体蛋白和CD44v10受体蛋白可使肿瘤在肺部的转移量分别降低70%和60%，CD44单克隆抗体也取得了基本相同的效果。近年来，随着纳米载药系统研究的兴起，纳米颗粒连接靶向分子HA，针对肿瘤细胞表面CD44进行肿瘤靶向治疗取得很大进展。Auzenne等［6］发现 HA-PTX纳米颗粒对CD44阳性人卵巢癌细胞SKOV-3ip和NMP-1的杀伤活性明显大于单纯PTX，加入过量游离的HA能够阻断这种增强的杀伤活性，提示HA-PTX通过靶向细胞表面CD44，达到增强杀伤细胞的效果。

虽然许多学者成功以CD44为靶点，HA为靶向分子，靶向杀伤肿瘤，提高药物疗效［7-8］。但是，关于以CD44为靶点靶向杀伤肿瘤细胞的同时，是否会靶向杀伤高表达CD44的正常细胞这一问题，少有报道。研究显示CD44与HA的结合并不完全是自发的，不同活化状态的CD44与HA的结合活性不同，与 CD44糖基化［9］、细胞类型［10］和 HA 自身状态［11］等因素相关。许多肿瘤细胞如乳腺癌细胞、肺癌细胞表面CD44处于活化状态，不需要任何刺激因素即能自发结合HA［12］。正常细胞表面CD44处于何种状态，是否存在上述调控，目前仍未阐明。我们通过检测CD44与其天然配体HA的结合活性，探讨正常细胞和乳腺肿瘤细胞表面CD44的活化状态是否存在差异，旨在深入分析以HA为靶向分子，CD44为靶点进行肿瘤靶向治疗的可行性，明确HA是否选择性靶向肿瘤细胞表面CD44，而不靶向同样高表达CD44的正常细胞。

材料和方法

一、细胞

乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549，正常小鼠胚细胞NIH3T3均购自中国科学院典型培养物保藏中心;分离20名正常人肝素钠抗凝血获取其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。

二、主要试剂

RPMI1640培养液、DMEM培养液均购自GIBCO公司，淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司，PE标记的鼠抗人CD44单克隆抗体，PE标记的鼠抗人CD44同型对照抗体均购自eBioscience公司，PE/Cy5标记的鼠CD44单克隆抗体购自Abcam公司，荧光标记的透明质酸(FL-HA)购自Calbiochem公司。

三、细胞培养

将Hs578T细胞在DMEM培养液(含10%胎牛血清、0.01 mg/mL牛胰岛素)中常规培养;BT-549细胞在RPMI1640培养液(含10%胎牛血清、0.023 U/mL牛胰岛素)中常规培养;NIH3T3细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养。培养条件均为5%CO2、37℃，饱和湿度。所有实验细胞均取自对数生长期。

四、Ficoll法分离人外周血单个核细胞

取正常人肝素钠抗凝血4 mL，加入等体积磷酸盐缓冲液(PBS)充分混匀，将其缓慢加入适量淋巴细胞分离液中，800×g水平离心15 min，小心吸取白膜层，用PBS 400×g离心10 min洗涤2遍，即获取人外周PBMCs。

五、流式细胞术鉴定细胞表面CD44的表达

分别取肝素钠抗凝血100 μL，加入2个流式专用管中，实验组加入适量CD44-PE单克隆抗体，阴性对照加入等体积CD44-PE同型对照抗体，轻轻混匀，室温避光孵育15～30 min后，在QPREP免疫学样品制备仪(COULTER公司生产)上处理血标本，流式细胞仪分析结果。0.25%胰酶分别消化处于对数生长期的NIH3T3细胞、Hs578T细胞和BT-549细胞，显微镜下观察。细胞呈单细胞悬液时用含血清的培养液终止消化，200×g离心5min，弃上清，再用适量PBS洗涤2遍计数，所有细胞均按每管约106个细胞的比例，收集至2个Eppendorf管中。NIH3T3细胞实验组加入适量鼠CD44单克隆抗体，乳腺肿瘤细胞实验组加入适量鼠抗人CD44单克隆抗体，对照组加入等体积CD44同型对照抗体，室温避光放置15～30 min，PBS 洗涤2 遍，500 μL PBS 重悬，移至流式管中上机检测，收集10 000个细胞，荧光强度以对数放大，结果用CD44细胞的阳性率表示，数据用软件进行分析。

六、流式细胞术检测细胞表面CD44的活化状态

用Ficoll法分离获取2管人外周PBMCs，每管细胞数量约在106左右。0.25%胰酶分别消化处于对数生长期的小鼠胚细胞NIH3T3和乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549，显微镜下观察。细胞呈单细胞悬液时用含血清的培养液终止消化，200×g，离心5 min，弃上清，再用适量PBS洗涤2遍，PBS重悬后计数，所有细胞均按比例收集于2个Eppendorf管中，每管约106个细胞。每种细胞均分为实验管和对照管，实验管加入40 μg/mL FL-HA 100 μL 重悬，对照管加入100 μL 培养液，37℃避光孵育2 h。然后用PBS洗涤2遍，移至流式管中，上机检测。

七、细胞免疫荧光法观察FL-HA与细胞表面CD44的靶向结合作用

分别收集对数生长期的小鼠胚细胞NIH3T3和人乳腺肿瘤细胞 Hs578T、BT-549，消化至单细胞呈单个悬液，接种到24孔培养板中，培养24～48 h，随机分为实验组和对照组，每组设双复孔，实验组加入 40 μg/mL FL-HA 200 μL，对照组加入200 μL培养液，37℃避光孵育1 h，PBS洗涤2遍，荧光显微镜下观察。

八、统计学方法

结 果

一、正常细胞与肿瘤细胞表面CD44的表达

正常人 PBMCs、NIH3T3细胞及 Hs578T细胞、BT-549细胞均高表达CD44，见图1。CD44细胞的阳性率分别为(99.57±0.31)%、(99.26±0.81)%、(99.85±0.21)% 和(99.99±0.10)%，各组间CD44表达差异无统计学意义(P ＞0.05)。

二、正常细胞与肿瘤细胞表面CD44的活化状态

正常人 PBMCs、NIH3T3细胞表面 CD44与HA结合活性较低;乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549表面CD44与HA结合活性较高，CD44处于活化状态，见图2。CD44活化阳性率分别为(3.61±2.65)%、(14.33±1.35)%、(93.4±6.40)% 和(94.70 ±0.15)%，PBMCs、NIH3T3细胞与乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549表面CD44活化差异有统计学意义(P＜0.05)，提示上述正常细胞表面CD44处于相对静止状态，乳腺肿瘤细胞表面CD44处于活化状态。

图1 流式细胞术检测细胞表面CD44的表达

图2 流式细胞术检测细胞表面CD44的活化

三、FL-HA与细胞表面CD44的靶向结合

在荧光显微镜下观察可见，与FL-HA孵育后，NIH3T3细胞与对照组荧光强度无明显差异，表明FL-HA基本不与细胞表面CD44结合，无靶向作用，CD44处于相对静止状态;而乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549与对照组相比，细胞表面发呈现出强绿色荧光，提示FL-HA与肿瘤细胞表面CD44高度靶向结合，CD44处于活化状态，见图3。

图3 细胞免疫荧光观察FL-HA与细胞表面CD44结合活性

讨 论

近年研究发现，黏附分子CD44在许多恶性肿瘤细胞表面高度表达，如乳腺癌、结肠癌等。其与肿瘤的侵袭和转移密切相关，特别是与天然配体HA的结合在肿瘤恶性进展中的作用受到广泛关注［13］。目前已有学者运用HA、CD44单克隆抗体、CD44受体蛋白等阻断CD44与HA的结合，有效减小肿瘤体积，抑制肿瘤转移;以HA为靶向分子制作的药物通过结合靶点CD44有效地提高了药物在肿瘤部位的聚集，增加药物的生物利用度，达到靶向治疗肿瘤的效果。尽管许多学者已将肿瘤细胞表面高表达的CD44作为靶点进行肿瘤靶向治疗研究，但在HA-化疗药靶向结合肿瘤细胞表面CD44，提高药物对肿瘤细胞的杀伤效果的同时，机体许多正常细胞同样高表达CD44，是否能够免受靶向药物的杀伤，及其如何免受其杀伤的机制，目前少有研究。

本研究分析了正常人PBMCs、NIH3T3细胞和乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549表面的CD44表达及其活化状态——即其与HA的结合活性。首先采用流式细胞术检测上述正常和肿瘤细胞表面CD44的表达水平，结果显示正常人 PBMCs、NIH3T3细胞和乳腺肿瘤细胞Hs578T、BT-549均高表达CD44，阳性率在95%以上，验证了在正常细胞和肿瘤细胞表面CD44均存在高表达的现象。在此基础上，应用FL-HA通过流式细胞术检测CD44与HA的结合活性。结果显示正常人PBMCs、NIH3T3细胞表面CD44与HA结合的活性较低，分别为(3.61±2.65)%和(14.33±1.35)%;乳腺肿瘤细胞表面CD44与HA的结合活性远远高于正常人PBMCs和NIH3T3细胞，均高于90%。正常与肿瘤细胞表面CD44与HA的结合活性存在相对差异。

本研究进一步阐明了正常细胞和肿瘤细胞表面CD44的活化状态差异影响HA与其靶向结合的能力。NIH3T3细胞中加入FL-HA孵育后，荧光显微镜下观察显示NIH3T3基本无荧光，提示CD44处于相对静止状态，FL-HA与其靶向结合很弱。而肿瘤细胞表面呈现强绿色荧光，提示乳腺肿瘤细胞表面CD44处于活化状态，FL-HA与其有很强的靶向结合活性。这一现象说明以HA为靶向分子，以CD44为靶点制备抗肿瘤药物，药物能够选择性靶向高表达CD44的肿瘤细胞，有效提高药物对肿瘤的杀伤作用，但同样高表达CD44的正常细胞，由于CD44处于相对静止状态，与HA结合活性较低，药物对其无靶向及杀伤作用。这一结果提示，HA在靶向杀伤高表达CD44的肿瘤细胞时，机体高表达CD44的正常组织可以免受其杀伤。

综上所述，本研究初步发现了CD44分布于正常和肿瘤细胞上的活化状态不同。以HA为靶向分子、CD44为靶点进行肿瘤靶向治疗时，能够特异杀伤肿瘤细胞，有效避免靶向杀伤高表达CD44的正常细胞，为以CD44为靶点进行的肿瘤靶向治疗研究提供了新的依据。但本研究对CD44活化状态的研究尚处于初级阶段，所用细胞局限为乳腺肿瘤细胞，其他肿瘤尚未涉及，有待进一步探索。另外，有关正常与肿瘤细胞表面不同活化状态CD44的产生机制及其生物学意义，仍需进一步深入研究。

［1］Orian-Rousseau V.CD44，a therapeutic target for metastasising tumours［J］.Eur J Cancer，2010，46(7):1271-1277.

［2］Toole BP，Slomiany MG.Hyaluronan，CD44 and Emmprin:partners in cancer cell chemoresistance［J］.Drug Resist Updat，2008 ，11(3):110-121.

［3］Coussens LM，Werb Z.Inflammatory cells and cancer:think different［J］.J Exp Med ，2001，193(6):F23-F26.

［4］Ponta H，Sherman L，Herrlich PA.CD44:from adhesion molecules to signalling regulators［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4(1):33-45.

［5］Zawadzki V，Perschl A，Rösel M，et al.Blockade of metastasis formation by CD44-receptor globulin［J］.Int J Cancer，1998，75(6):919-924.

［6］Auzenne E，Ghosh SC，Khodadadian M，et al.Hyaluronic acid-paclitaxel:antitumor efficacy against CD44(+)human ovarian carcinoma xenografts［J］.Neoplasia，2007，9(6):479-486.

［7］Journo-Gershfeld G，Kapp D，Shamay Y，et al.Hyaluronan oligomers-HPMA copolymer conjugates for targeting paclitaxel to CD44-overexpressing ovarian carcinoma［J］.Pharm Res，2012，29(4):1121-1133.

［8］Cho HJ，Yoon IS，Yoon HY，et al.Polyethylene glycol-conjugated hyaluronic acid-ceramide selfassembled nanoparticles fortargeted delivery of doxorubicin［J］.Biomaterials，2012 ，33(4):1190-1200.

［9］Rodgers AK，Nair A，Binkley PA，et al.Inhibition of CD44 N- and O-linked glycosylation decreases endometrial cell lines attachment to peritoneal mesothelial cells［J］Fertil Steril，2011，95(2):823-825.

［10］Tzircotis G，Thorne RF，Isacke CM.Chemotaxis towards hyaluronan is dependent on CD44 expression and modulated by cell type variation in CD44-hyaluronan binding［J］.J Cell Sci，2005，118(Pt21):5119-5128.

［11］Lesley J，Gál I，Mahoney DJ，et al.TSG-6 modulates the interaction between hyaluronan and cell surface CD44［J］.J Biol Chem，2004，279(24):25745-25754.

［12］Richter U，Wicklein D，Geleff S，et al.The interaction between CD44 on tumor cells and hyaluronan under physiologic flow conditions:implications for metastasis formation［J］.Histochem Cell Biol，2012，137(5):687-695.

［13］Hanagiri T，Shinohara S，Takenaka M，et al.Effects of hyaluronic acid and CD44 interaction on the proliferation and invasiveness of malignant pleural mesothelioma［J］.Tumour Biol，2012，33(6):2135-2341.