耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属β－内酰胺酶的检测及耐药性分析

何力志，黄露萍，李志芳，彭爱红

(湖南省第二人民医院，湖南长沙410007)

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)对亚胺培南等碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制主要包括产碳青霉烯酶、外膜孔蛋白OprD缺失或表达下降、主动外排泵系统表达增高等。目前，在PA中发现的碳青霉烯酶主要是金属β-内酰胺酶(metallo-betal-lactamase，MBL)。PA中编码 MBL的基因大多由质粒携带，且定位于整合子上。虽然目前报道产MBL的PA数量仍较少，但由于整合子的传播特性使得 MBL的数量正在增加，随时可能引起医院感染的爆发和流行［1］。因此，加强对PA耐药性的检测和监控，分析其药物敏感性，指导临床合理用药，已成为防止耐药产生与蔓延并进行有效医院感染控制的一个重要环节。本研究对湖南省第二人民医院耐亚胺培南PA进行了MBL的检测及耐药性分析。

材料和方法

一、材料

1.菌株的收集和鉴定 全部460株PA分离自湖南省第二人民医院2009至2011年临床标本(排除同一患者同一部位的重复菌株)，其中痰液182株、咽拭子133株、创面分泌物69株、尿液60株、血液及引流液16株。标准菌株为PA(ATCC 27853)。

2.主要试剂与仪器 聚合酶链反应(PCR)引物合成及试剂购自上海生物工程技术服务有限公司，Microscan walkAway-40全自动微生物鉴定系统为美国德灵公司产品。水解酪蛋白胨(MH)琼脂、亚胺培南等药物敏感性纸片均为英国OXIOD公司产品。

二、方法

1.细菌鉴定与药物敏感性试验 所有分离菌株的培养鉴定严格按照《全国临床检验操作规程》进行，采用德灵Microscan walkAway-40全自动微生物鉴定系统对所有收集的菌株进行菌种鉴定及药物敏感性试验，药物折点采用美国临床实验室标准化协会(CLSI)2009年标准。

2.组合纸片法检测MBL表型 具体操作参照文献［2］，直径增大≥6 mm 为产 MBL株［3］。

3.PCR检测MBL基因型别 参照文献［4-6］设计引物 IMP-1 、IMP-2、SPM-1、GIM-1，然后进行PCR扩增［7］，PCR鉴定后送生工生物上海有限公司测序，结果在GenBank网上比对。

4.耐药性比较 比较2009至2011年不同年份耐亚胺培南PA产生比例，比较产与不产MBL耐亚胺培南PA耐药谱差异，并对MBL不同基因型别菌株耐药特征进行分析。

三、统计学方法

采用SAS 8.0软件进行统计分析，计数资料组间比较采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、2009至2011年PA亚胺培南耐药结果

460株PA中亚胺培南耐药菌株173株，占37.6%。2009至2011年耐亚胺培南PA比例分别为35.0%(49/140)、37.3%(57/153)、40.2%(67/167)，有逐年增高趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

二、MBL表型

采用组合纸片法检测MBL表型，173株耐亚胺培南PA中共检出MBL表型阳性PA 28株，占16.2%(28/173)。

三、MBL基因型别

28株MBL表型阳性PA共扩增IMP-1型阳性19株，VIM-2型阳性2株。见图1。

图1 PCR检测结果

四、测序结果

随机各选取1例IMP-1和 VIM-2引物扩增阳性的菌株送生工生物(上海)有限公司进行测序，测序结果直接在GenBank中进行序列对比分析，分别与 IMP-1 GenBank注册号AY1686359和VIM-2 GenBank注册号AF191564相同。

五、产与不产MBL耐亚胺培南PA耐药谱的比较

173株耐亚胺培南PA，其中产 MBL菌株21株，不产MBL菌株152株。产MBL菌株对美罗培南耐药率为95.2%，高于不产MBL菌株(73.7%，P＜0.05);产 MBL菌株对其他抗菌药物的耐药率均高于不产MBL菌株，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 产MBL菌株与不产MBL菌株对不同药物的耐药率［株(%)］

六、MBL不同基因型别菌株的耐药特征

产IMP-1型与VIM-2型MBL菌株引起耐药的共同特点是能水解大多数β-内酰胺类抗菌药物:哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮-舒巴坦，对阿米卡星以外多种抗菌药物耐药。19株IMP-1型菌株中，3株对所测抗菌药物全部耐药，6株为同一耐药模式，对环丙沙星、头孢他啶、头孢吡肟 、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、美罗培南、庆大霉素耐药，2株VIM-2型菌株全部对头孢他啶、头孢吡肟 、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、美罗培南、庆大霉素耐药。

讨 论

近年来，PA的临床感染逐渐增多，其对碳青霉烯类抗菌药物耐药菌株亦有逐年上升的趋势。王辉等［8］报道，2003至2004年中国10所教学医院PA对亚胺培南的耐药率为22% ～24%，2008年CHINET细菌耐药监测数据显示，PA对亚胺培南和美罗培南耐药率分别为30.5%、24.5%［9］。本研究临床分离的PA对亚胺培南耐药率从2009年的35.0%上升到2011年的40.2%。

产MBL是PA对亚胺培南耐药的重要机制之一，其基因位于细菌染色体或质粒上，可通过基因盒在不同细菌间水平传播耐药性。本研究173株耐亚胺培南 PA中产 MBL菌株 21株，非产MBL菌株152株。比较产与不产MBL耐亚胺培南PA耐药谱发现，产MBL PA对大部分抗菌药物耐药率要高于不产MBL PA，但除美罗培南外，差异无统计学意义。究其原因可能是PA的耐药机制极为复杂，往往不是由单一因素所造成，通常是几种机制共同作用的结果。碳青霉烯酶是导致其对亚胺培南和美罗培南高水平耐药［最低抑菌浓度(MIC)≥32 mg/L］的主要机制［10］。

本研究显示，PA产MBL基因型别不同，耐药性也不同。19株IMP-1型菌株中，3株对所测抗菌药物全部耐药，6株为同一耐药模式，2株VIM-2型菌株全部对头孢他啶、头孢吡肟 、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、美罗培南、庆大霉素耐药。IMP-1型和VIM-2型菌株，其耐药模式存在一定程度差异，可能与该克隆株在不同感染个体所受到的抗菌药物选择压力的差异有关，使其能自行启动某些耐药机制以适应其生存的环境。这提示，临床上应加强病原学检查，根据药物敏感性结果选择药物，以达到最佳抗菌效果。本研究IMP-1型菌株有6株为同一耐药模式，是否为同一克隆株还需通过肠杆菌将基因间重复序列(ERIC)PCR电泳进一步证实，但加强对产酶株的检测和监控，对防止耐药性的传播和流行十分必要。

［1］郭小慧.铜绿假单胞菌耐药机制的最新研究进展［J］.国际检验医学杂志，2011，32(9):968-971.

［2］陶 晶，张俊丽，瞿婷婷，等.铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶分布及产金属酶检测方法比较［J］.检验医学，2009，24(2):145-148.

［3］Bergès L，Rodriguez-Villalobos H，Deplano A，et al.Prospective evaluation of imipenem/EDTA combined disc and Etest for detection of metallo-beta-lactamaseproducing Pseudomonas aeruginosa［J］.J Antimicrob Chemother，2007，59(4):812-813.

［4］徐元宏，沈继录，杨伯侠，等.产金属酶合并外膜蛋白缺失的铜绿假单胞菌的检测［J］.中华医院感染学杂志，2005，15(10):1085-1089.

［5］Gales AC，Menezes LC，Silbert S，et al.Dissemination in distinct Brazilian regions of an epidemic carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa producing SPM metallo-beta-lactamase ［J］.J Antimicrob Chemother，2003，52(4):699-702.

［6］Castanheira M，Toleman MA，Jones RN，et al.Molecular characterization of a beta-lactamase gene，blaGIM-1，encoding a new subclass of metallo-betalactamase［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48(12):4654-4661.

［7］潘婉仪，黄宪章，杨 洁，等.广州地区产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的流行病学研究［J］.南方医科大学学报，2010，30(8):1893-1895.

［8］王 辉，陈民钧，倪语星，等.2003-2004年中国十家教学医院革兰阴性杆菌的耐药分析［J］.中华检验医学杂志，2005，28(12):1295-1303.

［9］汪 复，朱德妹，胡付品，等.2008年中国CHINET细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2009，9(5):321-329.

［10］Kucisec-Tepes N.Pseudomonas aeruginosa-a significant hospital pathogen and resistance to carbapenem［J］.Acta Med Croatica，2004，58(4):313-321.