65株临床分离MRSA的SCCmec基因分型及耐药性研究

王爱玲，纪 冰，孙万菊，孟 玮，安新业，宿振国，王连文，张玉梅

(1.滨州医学院附属医院检验科，山东滨州256603;2.滨州医学院病原生物学教研室，山东烟台264003)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistant Staphylococcus aureus，MRSA)是一种引起医院内获得性感染的多重耐药菌。1961年在英国发现了世界首例MRSA，从此MRSA的感染遍布全世界，并成为医院和社区获得性感染的主要病原菌。由于其耐药谱广、耐药强度高，给临床治疗带来了很大困难，也因此受到广泛关注和重视。了解MRSA的耐药情况，并对当前流行的MRSA临床株进行快速、准确地分型，对于临床合理选用药物、了解菌株来源以及制定MRSA感染的防控措施有重要意义。我们采用多重聚合酶链反应(PCR)对分离的MRSA进行基因分型及耐药基因检测，以了解MRSA的葡萄球菌盒染色体(SCCmec)基因型分布特征及耐药状况。

材料和方法

一、材料

1.菌株来源及鉴定 受检菌株均分离自滨州市某三级甲等医院各临床标本，共计115株;其中甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)50 株，MRSA 65株。菌株鉴定采用先德自动化微生物鉴定仪(英国)鉴定，MRSA的筛选应用美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的头孢西丁纸片扩散法进行筛选。质控菌株金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)为本实验室保存。

2.主要试剂与仪器 细菌基因组DNA提取试剂盒、100 bp DNA Ladder Marker、PCR 试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司，溶葡萄球菌酶购自生工生物(上海)有限公司。抗菌药物:青霉素、氯霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/达福普汀、万古霉素、替考拉宁、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、红霉素、加替沙星、庆大霉素、利福平 、四环素、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢曲松、氨苄西林 、复方磺胺甲口恶唑购自OXIOD公司(英国)。水解酪蛋白胨(MH)琼脂购自杭州天和生物有限公司。

二、方法

1.金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取 参照试剂盒说明书进行。

2.SCCmec的多重PCR扩增分型 SCCmec复合扩增引物及反应条件参考Zhang等［1］的报道并做适当改变，PCR总反应体积为25 μL，反应条件为:94℃预变性5 min，然后94℃变性45 s，65℃ 退火45 s，72℃延伸90 s，进行10个循环;再94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，进行25个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳法，以100 bp Ladder DNA Marker为相对分子质量标准，在2%的琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像系统观察结果。SCCmec Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd、V 型分别出现 613、398、280、776、493、200、881、325 bp 条带，147 bp条带为mecA基因内部片段。SCCmec分型引物由上海英骏生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

3.药物敏感性试验 采用纸片扩散法测定19种抗菌药物的敏感性，分别以金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)为质控标准株。

4.耐药基因的PCR扩增 对分离的65株MRSA菌株进行aac(6')/aph(2'')、aph(3')Ⅲ、tetM及ant(4')4种耐药基因的PCR扩增，引物序列及产物长度参考有关文献［2］，见表2。PCR总反应体积为 25 μL，反应条件为:93℃预变性2 min，93 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 个循环，最后72℃延长5 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统观察结果。

表1 SCCmec分型引物序列

表2 MRSA耐药基因扩增引物序列

结 果

一、SCCmec分型

所检测的65株MRSA SCCmec的多重PCR扩增分型结果均出现147 bp的mecA基因条带，其中60株同时出现280 bp条带，为SCCmecⅢ型的MRSA，4株出现776 bp的条带，为SCCmecⅣa型的MRSA，1株未分型。见图1。

二、4种耐药基因扩增结果

aac(6')/aph(2'')基因的阳性率为93.85%，aph(3')-Ⅲ基因的阳性率为52.31%，tetM基因的阳性率为92.31%，ant(4')基因的阳性率为9.23%。见图2。

三、药物敏感性试验

质控标准菌株的各种抗菌药物敏感性结果均在CLSI规定的范围内，65株MRSA对19种抗菌药物敏感性试验结果见表3。

图1 部分MRSA的SCCmec多重PCR分型图谱

图2 部分MRSA aac(6')/aph(2'')、aph(3')Ⅲ、tetM及ant(4')4种耐药基因扩增结果

表3 65株MRSA对19种抗菌药物的药物敏感性结果

讨 论

目前认为MRSA耐药机制是MSSA获得了SCCmec元件，由SCCmec元件上mecA基因编码产生青霉素结合蛋白(PBP2a)，其与β-内酰胺类抗菌药物的亲和力低，从而产生对抗菌药物的耐药。对SCCmec进行分型的方法很多，DNA测序可以很好的诠释SCCmec基因岛的结构，但因其操作复杂、费时费力并且价格昂贵，不适于进行临床筛查及推广应用。多重PCR分型方法因其简单快速、成本低等优点，成为临床大规模筛查SCCmec基因型别的重要工具。2002年，Oliveira等［3］首次报道了用多重PCR对SCCmec进行分型，2007年对原方法进行了改进［4］。但该方法是根据同时扩增出现的多条带形成的谱型来判定不同的型别，对于没经验的研究者来说结果解释和判断存在一定的困难。2005年Zhang等［1］开创了一种新型的多重PCR(简称Zhang法)，是目前公开发表的唯一的单片段多重PCR分型方法，因每个型别对应1条特异条带，使其对SCCmec型和亚型的检测和分类更加简便可行，结果更易判断。

目前通过对SCCmec基因分型的结果研究还发现，MRSA来源背景不同，SCCmec基因分型结果也不相同。来自医院感染的MRSA主要基因型别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型，很少为Ⅳ型，其耐药特点是对多药耐药;而来自社区感染的MRSA菌株基因型别为Ⅳ型，耐药特点是对非β-内酰胺类的抗菌药物敏感。不同类型的SCCmec不仅分布于不同环境，而且在世界不同地区流行的MRSA菌株携带的SCCmec类型也是不相同的。在亚洲除日本和韩国的MRSA株主要携带Ⅱ型SCCmec基因型外，其他国家大多数分离的MRSA株均携带Ⅲ型SCCmec［5］。我国的严雪萍、潘军、邵冬华、张楠等［6-9］学者对各地区分离的MRSA SCCmec检测表明，我国分离的MRSA携带的SCCmec基因型也以Ⅲ型为主，同时也有不同比例的其他型SCC-mec存在。本研究对所检测的65株MRSA进行SCCmec扩增分型，结果表明60株为SCCmecⅢ型的MRSA，4株为SCCmecⅣa型的MRSA，说明引起本地区感染的MRSA以SCCmecⅢ型为主，主要为医院获得性感染，和国内报道一致。

药物敏感性结果显示65株MRSA全部为多重耐药株，即对3种类型以上的抗菌药物耐药。65株MRSA对青霉素类、头孢菌素类全部耐药，对庆大霉素、红霉素、四环素、克林霉素耐药率均＞90%，对氯霉素的耐药率比较低，为4.62%。对这些菌株耐药基因的检测表明，本地区分离的携带SCCmecⅢ型MRSA的氨基糖苷类耐药基因aac(6')/aph(2'')阳性率为93.85%，四环素类耐药相关基因tetM的阳性率为92.31%，有着非常高的阳性率，与有关报道［10］相符，也符合医院感染MRSA的耐药基因携带特征。

MRSA已成为医院及社区获得性感染的主要病原菌，因其耐药率高，由其引起的感染病死率较高，如监测和控制不当，将引起医院或社区感染的爆发。因此了解各地MRSA的发生率、SCCmec分型特点，进一步阐明MRSA耐药分子机制及其基因分型，为积极开发新的抗菌药物提供理论依据，从而切断MRSA的传染源和传播途径，预防其爆发流行。

［1］Zhang K，McClure JA，Elsayed S，et al.Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec Types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.J Clin Microbiol，2005，43(10):5026-5033.

［2］黄支密，陆亚华，陈 榆，等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因及β-内酰胺类抗生素耐药相关基因检测［J］.中华医院感染学杂志，2005，15(2):121-123.

［3］Oliveira DC，de Lencastre H.Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.Antimicrob Agents Chemother，2002，46(7):2155-2161.

［4］Milheirico C，Oliveira DC，de Lencastre H.Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(9):3374-3377.

［5］Ko KS，Lee JY，Suh JY，et al.Distribution of major genotypes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus clonesin Asian countries［J］. JClin Microbiol，2005，43(1):421-426.

［6］严雪萍，陈日炳，崔海燕.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的SCCmec检测及耐药性分析［J］.临床和实验医学杂志，2010，9(23):1771-1772.

［7］潘 军，刘文恩，张运丽，等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec基因分型及PVL基因研究［J］.中华医院感染学杂志，2010，20(17):2541-2544.

［8］邵冬华，徐国宾.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec分型方法的比较［J］.实用医学杂志，2010，26(9):1633-1636.

［9］张 楠，赵志军，贾 伟，等.宁夏地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子流行病学研究［J］.检验医学，2011，26(5):287-290.

［10］胡志东，李 金，马 睿，等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因及耐消毒剂基因的研究［J］.中华医院感染学杂志，2006，16(5):481-484.