尿NGAL在顺铂化疗肿瘤患者肾小管损伤中的临床意义探讨

胡雷光，朱立岳，谢 芳，陈 坚，王昕蕾

(1.复旦大学附属华山医院静安分院检验科，上海200040;2.复旦大学附属华山医院静安分院肿瘤科，上海200040)

人类中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)最初被鉴定为一个相对分子质量为25 000的蛋白，通过共价键连接于人中性白细胞明胶酶，且不易降解［1］。多年来，尿NGAL作为一个能反映急性肾损伤且可进行危险度分层的生物标志物越来越吸引国内外医学界同仁的兴趣［2-7］。顺铂(DDP)是广泛应用于治疗多种肿瘤的有效的化疗药物，其作用有剂量依赖性，尤其是在肾脏中表现为高聚集、高排泄、高代谢，其肾毒性作用尤为突出［8］。动物研究发现，小鼠模型中通过顺铂诱导肾毒性损伤后，NGAL即可从肾小管细胞被快速诱导和分泌，不久可在尿中容易地被检测到和定量［9］。因此，如何降低药物性肾毒性，实现尽快诊断和干预，是目前临床急需解决的课题。我们通过检测DDP化疗患者的尿NGAL等反映肾功能的微量蛋白指标，探讨尿NGAL在判断肾小管损伤中的临床价值。

材料和方法

一、研究对象

选择2011年6月至2012年6月复旦大学附属华山医院静安分院肿瘤科住院的肿瘤患者58例，男25例，女33例，年龄55±7岁;罹患肺癌、乳腺癌、宫颈癌和腮腺癌等，均为经手术或病理确诊并接受顺铂(DDP)化疗。化疗前检查血肌酐值和尿常规均在生物参考区间内，临床上排除患有肾病史。58例患者中化疗前共收集到57份尿液标本，根据患者是否初次入院接受化疗分为已化疗组(32例)和未化疗组(25例);化疗后共收集54份尿液标本，其中53份与化疗前的标本相配对，余下1份为化疗后收集到的标本。

随机选取复旦大学附属华山医院静安分院体检中心体检正常者51名作为正常对照组，男22名，女29名，年龄54±8岁，经病史询问、体格检查以及血糖、肝肾功能和尿常规等检查排除有肾病等疾病史。

二、检测方法

1.仪器与试剂 雅培i1000全自动化学发光仪，NGAL试剂盒和质控品均为原装配套。日立7170s全自动生化分析仪。N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)试剂和质控品由浙江康特公司提供;α1-微球蛋白(α1-MG)、尿白蛋白(mAlb)及尿肌酐(UCr)试剂由关东化学公司提供，质控品由罗氏公司提供。

2.方法 正常对照者在体检时、肿瘤患者在化疗前24 h和化疗后24 h分别留取约20 mL随机尿，1 000×g离心10 min后留取上清液放置2管洁净的加盖样品管内，其中1管于当日在日立7170s全自动生化分析仪上检测 NAG、α1-MG、mAlb和Cr含量。另1管储存于-70℃冰箱内，集中检测NGAL含量。2台检测仪器均使用相应的质控品进行室内质量控制。

三、统计学方法

采用SAS8.02统计软件包进行统计分析。NGAL、NAG、α1-MG 和 mAlb测定结果以 UCr进行校正，即计算各项目与UCr的比值。各组比值数据经检验为非正态性分布，用中位数(M)［百分位(25% ～75%)］表示，使用均数间的多重比较的Levene’s检验，并进行方差统计分析，配对资料使用Wilcoxon符号秩和检验，异常检出率使用χ2检验。以NAG/UCr阳性作为肾小管损伤的判断指标，将全部观察对象分为有损伤和无损伤2组，统计结果并绘制NGAL/UCr受试者工作特征(ROC)曲线。

结 果

一、化疗前各组与正常对照组各项目检测结果比较

除未化疗组NGAL/UCr和NAG/UCr高于正常对照组(P＜0.05)外，已化疗组、未化疗组和对照组之间其余项目差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

二、肿瘤患者DDP化疗前、后的各项目检测结果比较

化疗前 NGAL/UCr、NAG/UCr、α1-MG/UCr与化疗后比较差异均有统计学意义(P＜0.05);而mAlb/UCr化疗前、后差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

三、化疗前、后 NGAL/UCr、NAG/UCr和 α1-MG/UCr异常检出率比较

化疗前 NGAL/UCr异常率与 NAG/UCr、α1-MG/UCr及3项指标联合检测的异常率比较差异均无统计学意义(P＞0.05);化疗后NGAL/UCr和3项指标联合检测的异常率明显高于NAG/UCr、α1-MG/UCr(P ＜0.05)。见表3。

表1 化疗前各组与正常对照组之间各项目检测结果比较

表2 肿瘤患者DDP化疗前、后各项目检测结果比较

表3 化疗前、后3项指标异常检出率比较 ［例(%)］

四、NGAL/UCr的ROC曲线分析

将所有162例研究对象以NAG/UCr的阴、阳性结果与NGAL/UCr结果相对应，绘制出ROC曲线。ROC曲线下面积(AUC)=0.770 1［95%可信区间:0.698 4～0.841 7］，按 α=0.05检验水准，诊断试验有判断能力，诊断价值中等，诊断切割点在1.15 mg/mmol(灵敏度为82.09%、特异性为61.05%)。见图1。

图1 NGAL/UCr诊断肾小管损伤的ROC曲线

讨 论

人类NGAL是一种小相对分子质量分泌性蛋白，属于lipocalin蛋白家族，近几年愈来愈得到医学界的兴趣和关注。NGAL最初被鉴定为一个由178氨基酸残段组成的单个多肽链，通过糖基化共价键与人中性白细胞明胶酶连接。分子克隆研究已提示人NGAL与诱导小鼠肾24p3基因产生的初级培养物相似，而X线晶体学实验显示在中性粒细胞和尿液中主要以单聚体、少许以二聚体或三聚体形式存在，随后的实验证明了NGAL是以一个复杂的共价键与相对分子质量为92 000的基质金属蛋白酶-9(MMP-9，明胶酶 B)相连接［1］。除此之外，NGAL主要与含铁细胞表面膜受体(24p3R)以配位体形式连接并参与细胞内铁离子的转运，在抗菌活力、炎性反应、胚胎形成和肿瘤生长中发挥重要的作用［10］。

NGAL在正常的人类组织包括肾、气管、肺、胃和肠中表达水平较低，但损伤的上皮组织可明显表达。cDNA芯片技术的研究发现在肾缺血损伤后的近曲小管上皮细胞中NGAL的表达显著增强。NGAL可在肾小管发生损伤时作为一个铁转移性蛋白，全部或部分定位于肾近曲小管，诱导上皮细胞的繁殖和修复促进这些细胞存活，对肾脏起到保护作用［2］。虽然血浆中的NGAL可以自由通过肾小球，但绝大多数是在肾近曲小管通过有效mRNA依赖性的内吞饮作用被重吸收。因此，尿液中出现NGAL仅可能是存在肾近曲小管损伤而妨碍其重吸收或体内合成的大量增加［3］。另外关于基因学实验报道，急性肾功能损伤时，在远端肾单位，尤其是在Henle’s弯的粗升攀枝和集合管中，产生一个快速和大量NGAL mRNA的正调节作用，其过度表达的目的是产生抗菌功能的作用，但结果使其合成增加而直接分泌入尿液中［5-6］。综合各项研究结果，NGAL能迅速、灵敏、特异地反映各种肾脏疾病的损伤及恢复过程，可作为检测早期肾小管损伤的生物学指标之一。

正常尿中有少量白蛋白存在，排泄量在0.03～0.3 mg/min的亚临床范围即mAlb。而α1-MG是一种相对分子质量仅为26 000的糖蛋白，由167个氨基酸组成。血浆中游离α1-MG可自由通过肾小球，但99%被近曲小管重吸收，主要用于评估肾脏早期损伤时肾小管功能。而NAG是一种高分子糖蛋白，相对分子质量较大，为140 000，也是体内一种重要的溶菌体水解酶，在近曲小管上皮细胞中含量尤高。因不能通过肾小球基底膜，被认为属于肾小管标志物。尿液中NAG明显增多的原因是肾小管受损时，上皮细胞脱落、破坏，NAG释放而产生［11-12］。因而尿NAG对于肾小管病变是一个已被公认的灵敏度和特异性较强的指标之一，可作为肾小管受损的早期诊断指标。

顺铂(DDP)是一种无机重金属，广泛应用于治疗多种肿瘤的有效的化疗药物，其作用有剂量依赖性，但有肾毒性的风险，频繁干扰着高剂量的使用所产生的抗肿瘤疗效。而DDP的病理作用机理之一是引起近端肾小管上皮细胞缺血、缺氧，甚至坏死，其早期往往首先损害肾近曲小管，尤其是近曲小管直段细胞，导致肾小管细胞结构和功能紊乱［13-14］。对于顺铂治疗而导致肾损伤如何采取早期发现和防治一直是众多学者研究的热点［9，13-15］。

本研究检测了肿瘤术后化疗患者和正常对照者尿NGAL、NAG、α1-MG 和 mAlb。结果显示，未化疗组NGAL/UCr和NAG/UCr高于正常对照组(P＜0.05)。提示术后未化疗的肿瘤患者相对于正常对照者已出现了轻度肾功能损伤，可能与手术或药物对肾功能产生一定的影响有关，相对于α1-MG和 mAlb，NGAL、NAG或更显敏感。已化疗组与未化疗组各项结果差异均无统计学意义(P＞0.05)。产生的原因可能为顺铂化疗效果虽然与其剂量成正相关，但是顺铂的早期轻度肾损害存在一定的可逆性，临床上可以通过化疗后使用消化道排毒和抗氧化剂的预防方法，降低药物对肾脏的损伤从而起到保护作用［14］。但从化疗前、后的对比分析来看，经DDP一个疗程化疗后，尿中 NGAL、NAG和 α1-MG均明显增高(P＜0.05)，而mAlb差异无统计学意义(P＞0.05)。这显示肿瘤患者化疗后尽管血Cr未出现异常，但已出现了轻度肾功能损伤，而DDP药物毒性作用主要是对近端肾小管造成损伤而不是肾小球，与文献［9，14-15］报道基本一致。分析各项指标的异常检出率可以发现化疗后NGAL/UCr和3项指标联合检测的异常率明显高于NAG/UCr、α1-MG/UCr(P＜0.05)。说明NGAL的灵敏度高于其他2项指标，而三者联合检测更显灵敏。从NGAL的ROC曲线分析，相对于公认的NAG判断指标，对肾小管受损有早期诊断价值的最佳阳性判断值为NGAL/UCr≥1.15 mg/mmol，此点的灵敏度为82.09%，特异性为61.05%。本研究认为要寻找临床对早期肾小管受损的最佳诊断值，应将疑似患者做长期的追踪研究直至尿常规、尿素和血Cr等肾功能指标出现阳性结果，其间能结合临床症状和肾穿刺或手术等病理检查的金标准将更加完善。此法有待于进一步地探讨和研究。

Haase等［7］通过多中心的研究报道，虽然血清肌酐尚未出现临床诊断性的改变，但尿中NGAL的增加可以判定患者的亚临床诊断和不良的治疗预后。随着不断深入的临床诊断和治疗的研究，对于肾功能轻微损伤的诊断手段也愈来愈多。尿NGAL/UCr对DDP化疗患者的肾小管损伤和功能减退的检出有一定的临床价值。对于药物性等肾毒性损伤，尿NGAL可以作为一种较为理想的生物标志物。

［1］须 静，胡晓波.中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的研究进展［J］.检验医学，2012，27(10):871-876.

［2］Mishra J，Ma Q，Prada A，et al.Identification of neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury［J］.J Am Soc Nephrol，2003，14(10):2534-2543.

［3］Schmidt-Ott KM，Mori K，Li JY，et al.Dual action of neutrophil gelatinase-associated lipocalin［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(2):407-413.

［4］蔡雷鸣，厉 倩，金才峰，等.血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测在急性肾功能损伤早期诊断中的临床意义［J］.检验医学，2012，27(4):287-290.

［5］Ma Q，Devarajan P.Induction of proapoptotic Daxx following ischemic acute kidney injury［J］.Kidney Int，2008，74(3):310-318.

［6］Srichai MB，Hao C，Davis L，et al.Apoptosis of the thick ascending limb results in acute kidney injury［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(8):1538-1546.

［7］Haase M，Devarajan P，Haase-Fielitz A，et al.The outcome of neutrophil gelatinase-associated lipocalinpositive subclinical acute kidney injury:a multicenter pooled analysis of prospective studies［J］.J Am Coll Cardiol，2011，57(17):1752-1761.

［8］Ramesh G，Reeves WB.Salicylate reduces cisplatin nephrotoxicity by inhibition of tumor necrosis factor-alpha［J］.Kidney Int，2004，65(2):490-499.

［9］Mishra J，Mori K，Ma Q，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin:a novel early urinary biomarker for cisplatin nephrotoxicity［J］.Am J Nephrol，2004，23(3):307-315.

［10］Devireddy LR，Gazin C，Zhu X，et al.A cell-surface receptorforlipocalin 24p3 selectively mediates apoptosis and iron uptake［J］.Cell，2005，123(7):1293-1305.

［11］ 托马斯.临床实验诊断学［M］.上海:上海科技出版社，2004:357-375.

［12］梁永正，史 伟，刘双信，等.肾小管功能检测在IgA肾病中的意义［J］.广东医学，2004，25(2):185-186.

［13］Gonzales-Vitale JC，Hayes DM，Cvitkovic E，et al.The renal pathology in clinical trials of cis-platinum(Ⅱ)diamminedichloride［J］.Cancer，1997，39(4):1362-1371.

［14］曾 健，劳 山.顺铂肾毒性机制及其防护的研究进展［J］. 中国实用医药，2008，3(10):194-195.

［15］Gaspari F，Cravedi P，Mandalà M，et al.Predicting cisplatin-induced acutekidney injury by urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin excretion:a pilot prospective case-control study［J］.Nephron Clin Pract，2010，115(2):c154-c160.