哌拉西林杂质及其制备方法研究

樊长莹

（山东安舜制药有限公司，山东乐陵 253611）

哌拉西林是一种人工合成的青霉素之一，具有广泛抗菌谱的能效。哌拉西林在应用过程中常与他唑巴坦与舒巴坦等内酰胺酶抑制剂一起应用，在临床中常用于含有β-内酰胺酶耐药细菌。在进行抗生素应用的过程中，尽管哌拉西林抗菌活性强，但是同样需要在抗生素的应用前开展细菌学的培养，若是有细菌耐药情况要按照药物敏感进行实验，随时进行抗生素调整进行治疗。

1 哌拉西林概述

哌拉西林化学名为（2S，5R，6R）-3，3-二甲基-6-[（R）-2-（4乙基-2，3二氧代-1-哌嗪甲酰胺基）-2-苯乙酰氨基]-3-氧代-4-硫杂-1-氮。分子量为517.66，分子式为C23H27N5O7S，结构式如图1所示。

1.1 哌拉西林的价值

哌拉西林是半合成氨脲苄类抗假单细胞菌青霉素，对于革兰阳性菌、革兰氏阴性菌在抗菌作用上极为明显，最为重要的是，哌拉西林对于绿脓杆菌有明显作用，在临床中的应用较为广泛。哌拉西林在对繁殖期细菌的灭杀效果明显，但对静止期细菌作用近无，所以药理中哌拉西林主要作为繁殖期杀菌剂的抗菌药物。哌拉西林对于人体而言，无较大副作用，是青霉素类抗生素过敏人群之外，多数人能够安全使用的药物。

1.2 哌拉西林生产路线

N-乙基双氧哌嗪、三乙胺、三甲基氯硅烷、三光气反应制备酰氯；之后酰氯和氨苄西林反应，制成粗品哌拉西林；将乙酸乙酯与水加入粗品哌拉西林之中，重视对反应温度的控制；加入碳酸氢钠，对pH进行调节；搅拌加速溶解，完全溶解后静置分层；活性炭加入水层进行脱色处理；抽滤；对滤液加入乙醇和乙酸乙酯，控制在适宜温度后滴加盐酸，进行pH调节；搅拌一定时间后，得到成品哌拉西林。

1.3 哌拉西林生产存在的不足

精制之后得到的哌拉西林成品再经过液相色谱检测，相对保留的时间为RRT=1.75时，会出现未知的杂质，但是这些杂质的制备研究相对较少，对其结构和毒性、分离、合成方法介绍也不明确、详细。在工业生产中，哌拉西林得到未知杂质的含量难以进行有效的控制，不能达成ICH指南要求中未知杂质不能大于0.05%要求，对于产品质量造成负面影响。因此，要使此类未知杂质结构和毒性得到确定，需要一种方法进行杂质纯品制备、结构确定，进而使其毒性得到明确。

2 哌拉西林杂质的制备

2.1 哌拉西林杂质概述

为了使传统哌拉西林在生产中的杂质问题得到解决，进行哌拉西林杂质结构的确认及制备。在本次发明中，对哌拉西林RRT=1.75未知杂质进行合成与纯化，对于所得纯度超过99%的纯品杂质进行分析，以此使杂质结构得到明确，如图2所示。该杂质是哌拉西林和乙醇开环酯化反应后所得产物，没有毒性。本次研究中对于哌拉西林RRT=1.75未知杂质纯品制备、结构确认，能够在哌拉西林杂质的定量、定性分析中应用，对于哌拉西林工业生产中质量控制有极为重大的意义。

图2 哌拉西林杂质的结构式

2.2 哌拉西林杂质的制备方法

2.2.1 哌拉西林杂质合成

将精制哌拉西林作为原材，使用碳酸氢钠与水溶解，哌拉西林与碳酸氢钠在质量比上要为1∶（0.16～0.25），最佳为1∶0.18，水与乙醇体积比要为1∶0.8到1.2，1∶1最佳；溶解后加入乙醇进行温度控制，温度为20～45℃，并进行搅拌，搅拌时间要达到20～50h，最好为20～30h，使其充分反应；完成反应后滴加酸溶液进行pH调节，酸为盐酸，要为2N到5N，pH为1.5～3.0，将析出产物抽滤；滤饼加水进行溶解，加热溶解最佳，溶解后进行降温并析出后，获得粗品哌拉西林杂质。

2.2.2 液相分离

色谱柱为Agient ZORBAX SB-CI8液相色谱柱，规格为150×4.6mm，5μm，选择体积比为1∶1的水和乙腈，加入磷酸二氢钾2.7g/L作流动相，流速则控制在40～60mL/min；对于得到的优选哌拉西林杂质样品溶液实施液相色谱分离操作，优选样品溶液指取哌拉西林粗品1g，并加入30～50mL乙腈进行溶解，搅拌到完全溶解后，添加流动相直到100mL所得到的样品溶液；液相分离中获得杂质含量不小于99%的杂质溶液。

2.2.3 杂质富集

对哌拉西林杂质含量不小于99%的溶液进行有机溶剂萃取，萃取中使用的有机溶剂主要有乙酸乙酯和二氯甲烷中的一种；在有机相得到干燥剂的处理之后，干燥剂是无水硫酸钠和无水硫酸镁的一种或两种混制；得到纯度大于99%的杂质结晶体。

3 实际实施过程

3.1 哌拉西林RTT1.75杂质制备

例1：取500mL三口瓶，对其加入成品哌拉西林10g、水100mL、乙醇100mL、碳酸氢钠8g、三口瓶在水浴锅中放置，将溶液的温度控制在25～30℃，将其搅拌15min，pH为7.97，溶液澄清，无固体。在搅拌达到25h后，溶液温度为27℃，pH为8.67，滴加HC1溶液2N，对滴加速度进行控制，完成滴加后温度为28℃，pH为1.96，进行搅拌1化之后进行抽滤，将得到的固体添加到250mL三口瓶中，并添加水100mL，使其升温到80℃，再搅拌30min，0℃降温冷却搅拌1h之后，对其抽滤后，进行干燥处理。之后对固体液相检测，杂质纯度达到了28.5%。

例2：取例1相同三口瓶，除碳酸氢钠2.0g，其他条件相同。之将瓶放置在水浴锅中，对溶液温度进行控制，为30～35℃，对其进行搅拌，时间为15min，pH为7.28，溶液澄清，无固体。温度为30～35℃的情况下搅拌30h，溶液温度为31℃，pH为7.24，滴加HC1溶液2N，注意对滴加速度的控制。滴加完成后pH为2.48，搅拌1h后进行抽滤。取250mL三口瓶，将固体加入其中，并添加水100mL，提升温度到80℃，进行搅拌30min后，再于0℃下降温冷却，之后搅拌1h，抽滤，干燥，对固体液相检测后，杂质纯度仅20%

3.2 哌拉西林RRT1.75杂质分离

在杂质分离的过程中，液相色谱条件为：色谱柱为Agient ZORBAX SB-C18液相色谱柱，规格为150×4.6mm，5μm；进样量为20μL；柱温为25℃。

在进行流动流动相的配置中，使用2 000mL烧杯，对其加入精制用水100mL与磷酸二氢钾5.4g，进行搅拌直到完全溶解，之后将色谱级乙腈1 000mL加入，搅拌均匀后等待使用。液相中，使用250mL烧杯将制备杂质1.0g添加到其中，加入乙腈30～50mL，搅拌到完全溶解，后加入流动相，直至溶解达到100mL。流速为4mL/min的情况下展开杂质分流，液相图如图3所示：峰三的位置进行取样，分别为A3-1、A3-2、A3-3、A3-4、A3-5，经过检测后杂质的纯度均超过90%，重复以上检测操作后，B3-1、B3-2、B3-3、B3-4、B3-5中B3-1纯度为88.1%，其与均超过90%；C3-1、C3-2、C3-3、C3-4、C3-5中，杂质纯度均超过90%；D3-1、D3-2、D3-3、D3-4、D3-5，D3-1纯度87.96%，其与杂质纯度均超过90%。对于四组杂质纯度超过90%的溶液进行合并，加入二氯甲烷500mL，并搅拌15min，之后将其静置分层。分层之后，水层加入二氯甲烷100mL，搅拌15min后，静置分层。进行有机层合并，将其置入1 000mL容量的三口瓶中，并添加无水硫酸镁50g，并进行搅拌30min，抽滤，将得到的滤液转入100mL单口瓶中，减蒸处理后获得固体，通过液相检测后明确RRT=1.5的杂质纯度达到99.18%，约计为100mL。

图3 液相图

3.3 杂质结构确认

根据得到的杂质成分进行其结构组成进行判断，谱图解析，如图4所示。

图4 哌拉西林杂质结构式

通过质谱分析明确（M-H）-=562.1。通过谱图解析中的数据来看，相比较哌拉西林而言，杂质分子中分别多了一个-NH、-CH2、-CH3，化学位移来看是为CH3CH2-O，NH是四元环开环之后与N连接的氢分子，结合分子量为563.1、合成路线、哌拉西林结构，确认哌拉西林在RRT=1.75时产生的杂质结构式为图4，杂质是为哌拉西林和乙醇开环酯化反应后所得产物，无毒性。

4 结束语

哌拉西林是现代临床中的常用药品，在生产中，静置一定时间出现杂质超标的现象，一定程度导致其生产成本增加。提出了哌拉西林杂质制备方法及结构确认，能够为此提出解决途径，一定程度上改善了哌拉西林工业生产中的质量与成本。