非小细胞肺癌中Per2的表达及其与预后的关系

池闯， 刘瑜， 林晓铭， 孙成超

（温州医科大学附属第一医院 心胸外科，浙江 温州 325000）

昼夜节律生物钟普遍存在于生物界，机体的生理、生化、行为过程中都表现出一定的昼夜节律变化，昼夜节律生物钟的紊乱可能导致肿瘤的发生。流行病学研究[1-2]表明，长期夜班女性患乳腺癌的概率明显高于正常上班人群，而长期夜班男性人群易患前列腺癌。Per2作为生物钟基因中的关键组成部分，亦可能与肿瘤的发生、发展有关，在胰腺癌、神经胶质瘤等[3-4]恶性肿瘤中均存在Per2表达的降低或缺失。我们采用免疫组织化学染色法检测非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）组织中Per2的表达，探讨其在 NSCLC发生、发展和转移过程中的作用及其与预后的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2005年1月到2006年12月在温州医科大学附属第一医院心胸外科手术治疗的NSCLC病例60例，其中男38例，女22例，年龄38～77岁，≤60岁的27例，＞60岁的33例。有吸烟史37例，无吸烟史23例；中央型24例，周围型36例；鳞癌28例，腺癌32例；高、中分化34例，低分化26例；I期14例，II期28例，III期18例；有淋巴结转移26例，无淋巴结转移34例。另选取同期肺大疱及肺囊肿手术中切除的正常肺组织共20例作为对照。随访日期以患者手术日起计算，截至2009年12月或患者死亡日期。

1.2 方法 鼠抗人Per2（M01）单克隆抗体购自ABNOVA公司；免疫组织化学SP试剂盒及其他试剂

均购自北京中杉金桥公司。组织蜡块4μm连续切片，二甲苯脱蜡，无水乙醇逐步水化，抗原修复，SP法免疫组织化学染色，严格按试剂说明书进行。以PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照。Per2染色以细胞核或细胞质出现黄色或棕褐色颗粒为阳性。高倍镜下随机选10个视野，各计数100个细胞，无阳性细胞为0分，阳性细胞1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。细胞无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分。上述两分值相乘≥2分为阳性。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS16.0统计学软件进行分析。计数资料采用x2检验；单因素分析采用Kaplan-Meier法并绘制累积生存曲线，用Log-rank检验；多因素分析采用COX比例风险模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Per2在NSCLC组织和正常肺组织中的表达情况 正常肺组织中Per2的阳性表达率为95.0%（19/20），而NSCLC组织中Per2的阳性表达率为71.7%（43/60），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。2.2 Per2的表达与NSCLC临床病理特征的关系 Per2的阴性表达与NSCLC的分化程度及TMN分期相关（P＜0.05，见表1），而与性别、年龄、是否吸烟、病理类型、大体分型及淋巴结转移等因素无相关性（P＞0.05）。

表1 Per2在NSCLC中的表达及其与临床病理特征的关系

2.3 NSCLC患者预后的单因素分析 本组60例NSCLC患者中，1年生存率为83.3%，2年生存率为63.3%，3年生存率为53.3%。采用Kaplan-Meier法进行单因素分析表明患者的术后3年生存率与分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况及Per2的表达状态相关，差异有统计学意义（P＜0.05，Per2生存曲线见图1）；而与性别、年龄、是否吸烟、病理类型、大体分型等因素无相关性（P＞0.05）。

图1 Per2表达的NSCLC的生存曲线

2.4 NSCLC患者预后的多因素分析 将经过单因素分析筛选出来的分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况及Per2的表达状态四项临床病理指标纳入COX比例风险模型，进行多因素分析，结果显示随着NSCLC分化程度的降低、TNM分期的进展、淋巴结的转移、Per2的阴性表达，患者死于肺癌的相对危险度增加，但四者均非影响NSCLC预后的独立危险因素（P＞0.05）。见表2。

表2 NSCLC预后的多因素分析结果

3 讨论

昼夜节律生物钟是由一组呈节律表达的生物钟基因及其相关蛋白产物作为特异核心元件组成的。哺乳动物的生物钟基因最早发现于下丘脑视交叉上核（SCN）中，以后又逐步发现其在外周组织中也有表达，包括CKIε、Clock、Per1、Per2、Per3，Bmal 1、dbp、Rev-Erbα和Cryl、Cry2。其基本分子机制就是生物钟基因及其蛋白产物构成的自主调节的转录—翻译负反馈回路，从而形成体内精准的24 h生物钟。Per2不但在昼夜节律的产生和维持中起着重要作用，而且在肿瘤抑制和体内DNA损伤反应中起重要作用。Fu等[5]研究发现Per2突变的小鼠与野生型小鼠相比，发生肿瘤的风险明显增高。王雅平等[6]通过免疫组织化学的方法检测人结直肠癌中Per2的表达发现，Per2在人结直肠癌中表达下调，且与结直肠癌患者年龄、肿瘤组织学分级、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期相关。我们实验发现，在正常肺组织和NSCLC组织中均有Per2的表达，但在NSCLC组织中Per2的表达明显降低（P＜0.05）；同时，Per2在NSCLC中的表达和肿瘤分化程度及TMN分期相关（P＜0.05），即肿瘤的分化程度越低，TNM分期越晚，Per2基因蛋白阳性表达率也愈低，提示生物钟基因Per2的阴性表达与NSCLC的发生和发展具有密切的关系。

通过病理类型和临床分期预测NSCLC的生存期效果并不理想，因此寻找一些与肺癌有关的分子标记物作为预后指标对于完善肺癌的多学科综合治疗，提高疗效具有重要意义。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、PTEN等因子[7]对NSCLC预后评估的作用已被大量实验所证实，而关于Per2对于肿瘤预后的价值研究尚少。Per2的抗肿瘤作用主要通过调控原癌基因、抑癌基因的表达，调节细胞周期有关基因的时间性表达，抑制VEGF激动剂的活性等方式进行，其表达的下调或缺失必然会使相关的肿瘤基因失去调控而促进肿瘤的生长、转移，影响肿瘤的预后。Filipski等[8]研究表明生物钟基因Per2 mRNA表达被抑制后，可导致p53表达的下调和c-myc的过表达，这两个作用都可促进肿瘤进展。Yang等[9]通过体外实验发现，下调Per2表达会提高CyclinD、CyclinE的表达水平，使乳腺肿瘤的生长加速，使肿瘤细胞生长节奏的日振幅量成倍增加。而Per2过表达可抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤细胞的凋亡率[10]。由此可见，Per2的表达状态可能成为肿瘤预后的评价指标之一。Oshima等[11]通过检测结肠癌患者生物钟基因的表达情况，发现Per2的表达降低可能是结肠癌预后不良的预测因子。Relles等[3]研究发现在胰腺癌中Per2的低表达和患者的预后显著相关，缩短患者生存时间。本研究在生存分析中通过单因素分析发现Per2的表达状态是影响NSCLC术后3年生存率的因素（P＜0.05），Per2阴性表达患者的3年生存率明显低于Per2阳性表达患者，我们认为Per2和NSCLC预后关系密切，在临床上可以把Per2作为判断NSCLC生物学行为及预后的一个评价指标。然而在多因素分析中我们发现Per2阴性表达的患者死于肺癌的相对危险度增加，但它不是NSCLC预后的独立危险因素，说明NSCLC的预后状况是多种因素共同作用的结果，如果将Per2和其相关因子进行联合检测可能能更好地揭示NSCLC的预后。同时通过检测NSCLC中Per2的表达也有助于进一步从分子生物学水平研究其在肿瘤发生、发展中的机制，从而为肺癌的生物治疗和基因治疗提供新的思路。

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