TLC－Raman联用技术检测部分头孢菌素类药物

许凤，李红梅，王乐平 （齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江齐齐哈尔161006）

头孢菌素类药物是临床上应用较广泛的抗菌类药物，其中头孢替唑钠为第一代半合成的头孢菌素衍生物，头孢羟氨苄为半合成第一代口服头孢菌素，头孢呋辛钠为第2代头孢菌素类抗生素，头孢他啶为第3代头孢菌素类抗生素，均收载于中国药典2010年版二部，目前这四种头孢菌素类药物市面上出现假药较多，为了维护消费者权益，保护人民的生命安全，本文建立了能同时检测头孢他啶、头孢替唑钠、头孢呋辛钠和头孢羟氨苄这4种药品的薄层（TLC）快速药检分析方法，并与拉曼光谱图法（Raman）联用，效果较理想。

1 材料

1．1 仪器 UP50超声波清洗器（南京垒君达超声电子设备有限公司）；YOKO－ZF三用紫外线分析仪（武汉药科新技术开发有限公司）；拉曼光谱仪NICOLET6700FT－IR NXR FTRAMAN MODULE（Thermo SCIENTIFIC）。

1．2 试药 注射用头孢他啶（上海新先锋药业有限公司，批号120313）；注射用头孢他啶（上海新先锋药业有限公司，批号110701）；注射用头孢替唑钠（天津新丰制药有限公司，批号110801）；注射用头孢替唑钠（天津新丰制药有限公司，批号111201）；注射用头孢呋辛钠（深圳致君制药有限公司，批号B20111001）；注射用头孢呋辛钠（深圳致君制药有限公司，批号B20111008）；头孢羟氨苄片（石药集团欧意药业有限公司，批号003101201）；头孢羟氨苄颗粒（石药集团欧意药业有限公司；批号064110150）。头孢他啶、头孢替唑钠、头孢呋辛钠、头孢羟氨苄等对照品均由中国食品药品检定研究院提供；薄层层析硅胶GF254、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、硝酸银、醋酸乙酯、冰醋酸、丙酮、氨水、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为分析纯。

2 方法

2．1 TLC法

2．1．1 溶液的配制 （1）对照品溶液：称取头孢他啶、头孢替唑钠、头孢呋辛钠和头孢羟氨苄对照品各适量于不同的容量瓶中，分别加pH7．0磷酸盐缓冲液［1］溶解制成每1 mL约含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再称取头孢他啶、头孢替唑钠、头孢呋辛钠和头孢羟氨苄对照品各适量置于同一量瓶中，加pH7．0磷酸盐缓冲液溶解制成每1 mL各约含1 mg的溶液，作为对照品混合溶液。（2）供试品溶液：称取头孢他啶、头孢替唑钠、头孢呋辛钠和头孢羟氨苄4个品种8个批次的药品各适量置于不同量瓶中，加pH7．0磷酸盐缓冲液溶解、振摇2 min后超声提取5 min，按标示量制成每1 mL约含1 mg的溶液，作为供试品溶液。

2．1．2 色谱条件 固定相：硅胶 GF254－0．5%羧甲基纤维素钠溶液（1∶3）研匀，湿法铺板，晾干，105℃活化1 h后置干燥器中备用；展开剂：醋酸乙酯－冰醋酸－丙酮－水＝5∶2∶2∶1＋适量氨水作为扫尾剂；点样量：2μL；显色方法：于254 nm紫外灯下检视。

2．1．3 系统适用性试验 依法［2］，将4种对照品溶液与对照品混合溶液各点样2μL于同一硅胶GF254薄层板上，饱和5～10 min后展开约20 min、展距约6～7 cm时分离效果较理想。将硅胶板取出晾干，于254 nm紫外灯下检视，结果如图1所示。

2．1．4 耐用性考查 在不同条件下，将对照品混合溶液作为考察对象，点样量为2μL，测定方法同上，考察15，25，35，45，55℃等温度和18%，32%，58%和88%等湿度对本展开系统是否有影响。最终结果显示温度和湿度的变化对本展开系统无影响，分离度及比移值均很理想。

2．1．5 测定 在“2．1．2”项的色谱条件下，在同一 GF245玻璃硅胶板上依次点对照品混合溶液、头孢他啶、头孢替唑钠、头孢呋辛钠和头孢羟氨苄等4个品种8个批次药品的供试品溶液各2μL，在层析缸中饱和5～10 min，展开20 min后，在254 nm下检视，结果如图2所示。

2．2 Raman法验证

2．2．1 扫描条件 FTIR扫描范围：400～4000 cm－1；拉曼光谱仪激光源：1064 nm，拉曼位移波数范围：100～3750 cm－1，扫描次数：32次，分辨率：8 cm－1。

2．2．2 测定 在图2～图5中的薄层板上的对照品斑点处与相应样品的斑点处点上自制的纳米银溶胶［3］，在“2．2．1”的扫描条件下进行Raman扫描，部分结果如图6～9。

3 结果

3．1 TLC法结果

3．1．1 系统适用性试验 将展开、晾干后的GF254硅胶板在紫外灯254 nm下检视，结果如图1所示，4点分离很好，比移值Rf0．2～0．8，也很理想。

图1 系统适用性试验TLC图Fig 1 TLC chromatograph of system suitability test

3．1．2 供试品测定结果 如图2所示，头孢羟氨苄颗粒剂斑点有拖尾现象，其产生原因主要是因为颗粒剂中辅料较多，除常用的稀释剂，润滑剂外还添加糖类做矫味剂，这些添加可能影响头孢羟氨苄的展开，使其斑点拖尾。

根据图2中Rf值和斑点颜色能够初步判定所检测的头孢他啶、头孢替唑钠、头孢呋辛钠和头孢羟氨苄等4个品种8个批次的药品都为正品。

图2 供试品TLC图Fig 2 TLC chromatograph of ceftazidine samples

3．2 Raman法结果

图3 头孢他啶Raman图Fig 3 Raman spectrum of ceftazidine

图4 头孢替唑钠Raman图Fig 4 Raman spectrum of ceftezole sodium

图5 头孢呋辛钠Raman图Fig 5 Raman spectrum of cefuroxime sodium

图6 头孢羟氨苄Raman图Fig 6 Raman spectrum of cefuroxime sodium

根据Raman图能够判定所检测的头孢他啶、头孢替唑钠、头孢呋辛钠、头孢羟氨苄等4个品种8个批次的药品都为正品，此结果与TLC检测结果相符。

4 讨论

头孢菌素类抗生素是分子中含有头孢烯的半合成抗生素。中国药典2010年版二部中收载的头孢菌素类药物制剂主要用化学法和HPLC法进行鉴别，都存在专属性不高的缺点。而现有文献所介绍的TLC法［4－6］固定相使用的是硅胶G或H、需要喷以显色剂方可显色，方法繁琐费时。在本研究中，因考虑到头孢菌素类药物结构中有共轭结构对紫外光有吸收，所以选用了硅胶GF254为固定相，在紫外灯254 nm下检视即可，方便省时。

因头孢菌素类药物分子结构非常相似，通常一个展开系统只能展开一种此类药物，欲将几种此类药物区分开来，在固定相确定后，流动相的选择至关重要。而现有文献所介绍的TLC法［1］流动相中使用了较大比例（70%）的四氢呋喃，虽然分离效果较理想，但因四氢呋喃为二类有毒试剂，对环境和人体伤害较大，本研究选用了毒性较小的醋酸乙酯∶冰醋酸∶丙酮∶水＝5∶2∶2∶1＋适量氨水为展开剂，由实验结果可知此TLC系统可同时检测头孢他啶、头孢替唑钠、头孢呋辛钠和头孢羟氨苄4种药物且展开速度较快，适用于基层药品检验。

以上TLC方法专属性仍不是很高，可用于该类药品的初筛，其结果需要做进一步分析验证。作为一种近年来发展迅速的光谱分析方法，拉曼光谱在某些方面有着独特的优势。使用拉曼光谱对样品进行分析，具有测试样品非接触性、非破坏性、时间短、样品所需量小及样品无需制备等优点［7－8］。拉曼光谱法专属性虽然很高，但对物质的纯度要求也较高，若为制剂，则辅料会对主成分的Raman光谱产生干扰，不利于主成分的识别［9］。而文献报道的薄层色谱制备技术［10］操作较繁琐，不利于基层快检。本研究在展开的薄层板上的对照品与对应样品的斑点处点上自制的纳米银溶胶以增强Raman响应信号［11］，再进行Raman扫描，既利用了TLC法分离的优势，又利用了Raman专属性高的特点，简便、快速。由检测结果可知Raman法适用于该类药物的定性鉴别。本研究不仅可以用于该头孢类药品的鉴别，而且将会在中药保健品中非法添加西药的鉴别方面有较大的发展空间。

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