丹七明目散提取物中淫羊藿苷与木犀草素含量的测定

田晗，刘敏，杨艳羚，李玉桑，唐和斌 （中南民族大学药学院，湖北 武汉430074）

丹七明目散提取物对视网膜病变具有潜在的治疗作用，其中的三七、黄芪能够抗氧化，改善微循环［1－2］。淫羊藿苷（icariin）是从淫羊藿中提取分离的一种黄酮类单体化合物［3］。木犀草素（luteolin）属于黄酮类植物化学物，主要存在于金银花、菊花、荆芥、白毛夏枯草等药物中，以及百里香、芽甘蓝、洋白菜、菜花、甜菜、椰菜和胡萝卜等蔬菜中［4］。因此，建立采用高效液相色谱法来准确测定丹七明目散提取物中淫羊藿苷和木犀草素含量的方法，对于该提取物的质量控制和确保其疗效具有重要的意义。

1 材料

戴安高效液相色谱仪（配有Ultimate 3000 Pump，Ultimate 3000 Autosampler，Ultimate 3000 Column Compartment，Ultimate 3000 Diode Array Detector）；METTLER TOLEDO分析天平（Made in Switzerland，AB265－S型）。淫羊藿苷对照品（批号110737－200415，供含量测定用，中国食品药品检定研究院）；木犀草素对照品（批号111520－200504，供含量测定用，中国食品药品检定研究院）。甲醇、磷酸为分析纯；乙腈为色谱纯（美国Fisher），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 色谱柱：YCM－Pack ODS－A C18（250 mm×4．6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）－0．1%磷酸溶液（B）按照表1的比例进行梯度洗脱；检测波长：270 nm；流速1．0mL·min－1；柱温：30℃；进样量：10μL。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 The procedure of gradient elution

2．2 溶液的制备

2．2．1 对照品溶液制备 精密称定淫羊藿苷对照品约5 mg和木犀草素对照品约2 mg，分别至25 mL量瓶中，用甲醇溶解，摇匀，定容至25 mL制成对照品母液，并用0．45μm微孔滤膜过滤备用，4℃冰箱保存。

2．2．2 供试品溶液制备 丹七明目散提取物的制备：该提取物包含丹参（安徽，批号120501），三七（云南，批号091101），杭白菊（浙江，批号120401），淫羊藿（甘肃，批号120601），黄 精 （湖 南，批 号 121101），麦 冬 （湖 北，批 号121001）6味药，其中淫羊藿、丹参、黄精3味中药采用水提醇沉法，三七、杭白菊、麦冬3味中药采用70%乙醇提取3次，浓缩合并提取物，干燥备用［2］。然后精密称取其提取物1．90 g，置于10 mL量瓶中，并用纯化水定容至刻度，密塞，超声处理10 min，放冷，摇匀，用0．45μm微孔滤膜过滤作为供试品溶液，放置于4℃冰箱中存储，备用。

2．2．3 阴性样品溶液制备 按处方比例制备不含淫羊藿和杭白菊的阴性对照样品，并按照“2．2．2”项下供试品溶液的制备方法，制得阴性对照溶液。

2．3 干扰实验 按照“2．1”项下的色谱条件，分别对上述对照品、供试品、阴性样品溶液进样10μL。结果阴性样品在与供试品和混合对照品相同保留时间处，无干扰峰的出现，可确定丹七明目散提取物中其他药材成分对淫羊藿苷和木犀草素的含量测定不产生干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图A．混合对照品；B．供试品；C．阴性对照；1．木犀草素；2．淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatograms of reference substance（A），sample（B）and negative control（C）1．luteolin；2．icariin

2．4 线性关系考察 精密吸取淫羊藿苷和木犀草素对照品母液，各1，2，4，6，8 mL置10 mL量瓶中，分别用甲醇定容，将定容后的溶液进样，并且按“2．1”色谱条件测定，以对照品的浓度（X，mg·mL－1）为横坐标，色谱峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。淫羊藿苷和木犀草素的回归方程分别为：Y＝12 304X＋7．642 0（r＝0．999）；Y＝18 857X－9．912 9（r＝0．999 8）。结果表明，淫羊藿苷进样浓度在0．02～0．16 mg·mL－1范围内与峰面积呈良好的线性关系；木犀草素进样浓度在0．008～0．064 mg·mL－1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2．5 精密度试验 取淫羊藿苷和木犀草素混合对照品溶液，重复进样6次，记录峰面积，结果淫羊藿苷峰面积RSD为0．85%（n＝6），木犀草素的峰面积RSD为0．53%（n＝6）。

2．6 重复性试验 取同样的供试品，按“2．2．2”项下方法制备供试液，进样6次，分别测定峰面积，其中淫羊藿苷的RSD为0．59%（n＝6），木犀草素的RSD为1．01%（n＝6）。

2．7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，12，24 h按上述色谱条件试验，分别记录淫羊藿苷和木犀草素峰面积值，其峰面积的RSD分别为0．25%，0．83%。

2．8 加样回收率试验 精密称取同一批药材约1．90 g，再分别已按相当于药材含量的约80%、100%、120%量加入淫羊藿苷和木犀草素对照品溶液。由“2．2．2”项下的方法制备供试品溶液，进样分析，由测得量与加入量计算回收率，结果见表2，表明方法回收率良好。

表2 淫羊藿苷和木犀草素的回收率（n＝9）Tab 2 Recovery rates of Icariin and luteolin（n＝9）

2．9 样品含量测定 精密称取同一批次的3份药材样品，并按“2．2．2”项下供试品处理方法制备溶液，依法测定，记录峰面积，外标法计算药材中淫羊藿苷和木犀草素的含量，结果见表3。

表3 丹七明目散中淫羊藿苷和木犀草素含量测定结果（n＝3）Tab 3 The contents of icariin and luteolin in Danqimingmusan（n＝3）

3 讨论

参考2010年中国药典第一部以及其他相关报道，淫羊藿苷在270 nm处有最大吸收［5－7］，木犀草素在350 nm处有最大吸收［8－10］。但在实际的研究中发现，280～350 nm之间木犀草素的峰高变化没有太大区别，故最终采用270 nm。本研究采取梯度洗脱的方式。在梯度洗脱的方式中，作者尝试选择乙腈和水、乙腈和0．1%磷酸溶液和乙腈和0．3%磷酸溶液的3种流动相，然而结果中发现乙腈和0．1%磷酸溶液对供试品的峰型分离最优，故最终采用乙腈和0．1%磷酸溶液。

本实验首次建立了用HPLC测定丹七明目散中淫羊藿苷和木犀草素含量的方法，在含量测定的色谱条件下，淫羊藿苷和木犀草素与其他组分能够达到较好分离，精密度、线性关系、重复性均符合测定要求，可为丹七明目散的质量控制提供可借鉴的定量方法。并且在后期研究该药物的药理机制中提供较有价值的相关参考。

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