米诺环素对不完全脊髓损伤大鼠脊髓BDNF和NT－3表达的影响

段冰玉 周厚纶 任航空

（华中科技大学同济医学院解剖学系，武汉430030）

脊髓损伤是一种常见且后果极其严重的疾病，是一种能被促炎性因子诱导继发性损伤联级的综合性疾病［1］。大部分的损伤是一些继发性损伤，这些继发性损伤为缓解疾病提供了一个时间窗以阻止损伤的蔓延。传统的康复训练结合药物治疗，虽然能在一定程度上改善患者的肢体功能［2］，但恢复效果仍不明显。已有越来越多的报道证实脊髓损伤的治疗与神经再生有密切的关系［3］。神经营养因子家族脑源性神经营养因子（BDNF）以及神经营养因子3（NT－3）在体内以及离体情况下，具有维持正常神经元的发育存活及其功能的重要作用［4］。这些营养因子对损伤后的神经修复包括轴突再生都有着支持作用，因此，上调保神经营养因子已成为研究脊髓损伤治疗方法的新方向。米诺环素是第二代半合成四环素类衍生物，它已被报道具有许多其他的作用，包括抗炎、免疫调节以及神经保护功能，有动物实验显示米诺环素可以抑制细胞凋亡过程中凋亡因子半胱天冬酶－1（caspase－1）以及caspase－3，也可以抑制诱导的NO合酶产生NO，并且可以减弱小胶质细胞的活化［5］。而在不完全脊髓损伤后，同样发生细胞凋亡，因此运用米诺环素治疗不完全脊髓损伤是有改善作用的。

然而，关于米诺环素治疗不完全脊髓损伤过程中通过增强保护性的因素，包括神经营养因子家族从而促进神经修复以及轴突再生这方面的机制的报道很少见。本实验着重于评估大鼠不完全脊髓损伤后，运用米诺环素治疗对大鼠运动神经功能恢复的影响，以及对BDNF和NT－3产生的影响。

材料和方法

1、实验动物以及分组

54只健康成年雌性SD大鼠（同济医学院实验动物中心提供），体重180g－210g。兔抗BDNF、兔抗NT－3、米诺环素（ABcom 公司），RT－PCR 试剂盒（Fermentas公司），引物（上海生工生物技术有限公司），50kb的DNA ladder、ABC试剂盒（中杉金桥公司），其余均为国产试剂分析纯。PCR仪，凝胶成像分析系统，低温高速离心机，冰冻切片机。

2、动物分组，模型制备

随机将动物分成空白对照组、生理盐水组、米诺环素治疗组三组，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，打开椎管，暴露脊髓，用克氏针击打脊髓，模型成功的标志是，麻醉清醒后，大鼠的双下肢不能够大幅度地活动。空白对照组仅仅咬开椎板，不进行损伤。米诺环素组以及生理盐水组大鼠需要每天早中晚按压膀胱人工排尿，直至其建立反射性膀胱排空。生理盐水组和治疗组在术前半小时、术后1h、术后24h、48h、72h分别腹腔注射生理盐水和米诺环素。

3、行为学观察

将各组大鼠分别置于平坦开阔的地面，使其有足够的空间自由活动，根据BBB评分进行盲评并记录。

4、RT－PCR

取每组大鼠8只在术后3d、7d、14d分别处死各组大鼠，取脊髓组织研磨并提取RNA进行逆转录后扩增并电泳观察结果。

5、免疫组化染色

取脊髓组织冰冻切片，DAB进行染色，最后将切片进行脱水透明封片并观察结果。

6、图像处理

PCR结果用ImageJ图像分析软件进行灰度值分析并绘图，免疫组化染色则用IPP图像分析软件进行阳性细胞计数测量。

7、统计学处理

使用SPSS13.0统计软件分析数据，数据结果采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义的标准。

结 果

1、各组大鼠的行为学观察

在三组动物模型中，损伤组（即生理盐水组）和治疗组都存在着下肢功能的缺失。

图1 三组大鼠的行为学评分Fig.1 Behavioral scores of three groups of rats

2、逆转录PCR

损伤组的BDNF和NT－3的mRNA表达较空白组对照组增多，P＞0.05，无统计学意义；米诺环素治疗组的BDNF和NT－3进一步增多，P＜0.05，有统计学意义。

3、免疫组化染色

在各正常对照组，大鼠脊髓的前角运动神经元和脊髓后角感觉神经元以及部分胶质细胞内可以见到少量的BDNF和NT－3免疫反应阳性产物，其亚细胞定位主要分布于细胞浆中。

讨 论

本实验中，使用改良Allen＇s法损伤脊髓，模型成功后大鼠双下肢不能活动和负重，然后进行治疗，根据行为学观察发现在治疗组中，大鼠后肢功能显著恢复，而生理盐水损伤组中，随着时间的持续，后肢功能有轻度的恢复，但是表现极不明显，一般不能负重。

在成年大鼠脊髓，BDNF和NT－3主要分布于灰质，特别是前角运动神经元。二者对腹角运动神经元和胶质细胞的存活功能正常发挥有重要作用。一般正常成年大鼠脊髓中极少含BDNF的mRNA，而损伤后机体自身产生保护性因子出现BDNF的mRNA，在治疗组中BDNF的mRNA表达比损伤组要多。同时治疗组中脊髓前角处的BDNF和NT－3的阳性细胞比损伤组阳性细胞数量显著增多。这两项都表明，使用米诺环素治疗后的大鼠脊髓中存在一定的反应使得神经保护性因子BDNF和NT－3表达增多［6］。这种脊髓损伤后大鼠体内应激性的神经因子阳性表达增高有一个自然过程，据报道7天左右神经因子就会降至正常水平［7］。机体在损伤后会自发的产生一些保护性因子，以减弱损伤，但这种作用还不足以使得机体恢复到损伤前的状态，米诺环素在这个基础之上，促进了保护性因子BDNF和NT－3的分泌。

实验中，我们可以得出米诺环素在治疗不完全脊髓损伤大鼠时能够上调BDNF和NT－3的表达。在米诺环素与神经系统疾病的报道中，还未能发现米诺环素治疗脊髓损伤后如何上调神经保护性因子BDNF和NT－3，有报道认为在新生大鼠中，BDNF能够诱导长时程增强（LTP）以及C－纤维的诱发电位，激活脊髓胶质细胞［8］。而已有实验证实米诺环素在治疗神经性疾病过程中抑制小胶质细胞的活化，究竟是什么样的机制还待进一步探究。米诺环素在不完全脊髓损伤疾病的治疗作用是肯定的，且其主要是综合性作用于各种途径保护脊髓，促进运动功能恢复，而不是作用于特定的某类分子。

综上所述，以前的研究多是集中于米诺环素的抑制损伤进一步进展的作用，偏重于从这个方面阐述米诺环素治疗神经性疾病的机制，而我们在这个实验中，运用米诺环素治疗明显上调了神经营养因子和神经生长因子的阳性表达，从而进一步保证了研究米诺环素适用于临床治疗不完全脊髓损伤的进展和前景。

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