年龄增长对GRK5基因缺陷小鼠海马内肿胀轴突丛形成与积累的影响

庞德芳 黄绮娟 侯晓彦 王富鑫 赵 斌 Suo Z.William 李龙宣＊

（1广东医学院附属医院生殖医学中心，2神经科，湛江524001；3 Lab.for Alzheimer’s Disease and Aging Research，Kansas City Veterans Affairs Medical Center，Kansas City，Missouri 64128，the Dept.of 4 Neurology and 5 Physiology，University of Kansas Medical College，Kansas City，Kansas 66170，USA）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以进行性痴呆为主要表现的中枢神经系统退行性病变。由于至今对晚期AD治疗几无疗效，因此有关AD早期发病机制与治疗方面的研究尤为重要。

近年的研究发现AD转基因动物脑内早期阶段即存在细胞膜上G蛋白偶联受体（G protein－coupled receptors）激酶5（GPCR kinase－5，GRK5）缺陷，而且这种缺陷在认知功能下降前就已出现，并一直持续到晚期阶段［1］。重要的是，在死后AD患者脑中也发现了类似改变［2］。这提示GRK5缺陷与AD间存在联系。

GRK5基因敲除小鼠（GRK5 Knockout，GRK5KO）老龄时（17－19月龄）表现出记忆缺失性轻度认知功能损害［3］，而这种轻度认知功能损害则是AD认知功能障碍的最初形式［3］。另外，研究发现GRK5KO小鼠的轻度认知功能损害与其伴随出现的轴突转运缺陷密切相关。这些特征性的轴突转运缺陷的形态学表现为海马内出现了一些肿胀的轴突丛（swollen axonal clusters，SACs），同时合并突触蛋白水平的减低。近期我们还发现GRK5KO小鼠脑内的轴突转运缺陷存在明显性别差异，雌性小鼠海马内SACs数量较雄性小鼠显著增加［4］。这与女性AD患者脑内病理改变比男性严重的现象极为吻合［5］。有证据表明，轴突转运缺陷可能是AD和其他神经变性疾病最早期的病理特征，也可能是AD发生的原因之一［6］。然而GRK5KO小鼠海马内SACs究竟在什么时候开始出现？GRK5基因缺陷与老化的交互作用对海马内SACs形成与积累的影响如何？目前均不清楚，弄清这些问题对深入阐明GRK5缺陷与AD病理发生间的内在联系具有重要意义。

材料和方法

1.实验动物及分组

GRK5KO小鼠由美国密州堪萨斯VA医学中心William Z Suo教授实验室提供，亲代基因敲除鼠具有C57／BL6种系背景。GRK5KO小鼠的建立［7］是通过靶向剔除小鼠GRK5基因序列中的外显子7和8（这是一段编码蛋白激酶裂解域中Ⅰ至Ⅲ的关键成分），导致GRK5基因无能。通过对有携带这种基因突变的小鼠进行近交繁殖。繁殖成功后其子代中将会出现野生型（wild type，WT）（GRK5＋／＋）以及 GRK5KO（包括杂合子 GRK5＋／－和纯合子 GRK5－／－）基因型。选取5、6、7、9、12－13、18－19月龄（mon）GRK5KO小鼠作为观察对象，另选取年龄匹配的 WT型小鼠为对照，每个年龄段GRK5KO和WT基因型小鼠各4只。由于GRK5KO小鼠都具有明显的性别差异［4］，所以我们仅选择雌性小鼠进行观察。动物饲养在SPF级动物房，恒温21℃。各组小鼠在层流架中分笼饲养，24h周期明暗交替照明，动物自由进食及饮水。所有的操作都按美国密州堪萨斯VA医学中心和广东医学院动物喂养和使用管理委员会制定的条例进行。

2.小鼠的基因鉴定

按照文献报道［7］的方法提取小鼠尾部基因组DNA，用三重聚合酶链反应进行扩增、并电泳鉴定。

3.组织的准备

如文献所示［8－9］：所有的小鼠在深度麻醉下，经左心室升主动脉快速灌注冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS，4℃，p H 7.4）25 ml，断头取脑，左侧半脑置入4%多聚甲醛（4℃，p H 7.3）中固定24h，而后置入4℃20%，30%蔗糖磷酸缓冲液中浸透用于病理学观察。所有的左侧半脑（GRK5KO与WT型组）均采用盲法编码以消除病理变化定量中出现的潜在偏差。相同年龄段GRK5KO与WT型动物的左脑包埋在同一个组织块中，这样可以保证后续的切片和染色在同一条件下进行以减少单个左脑单独操作产生的误差。在Leica恒冷箱切片机内制作左脑冷冻标本冠状连续切片（贴片法），片厚20μm，收集全部切片，分为5组，每组间隔150μm。

4.免疫荧光染色

免疫荧光染色（immunofluorescent，IF）采取贴片法。切片经0.25%Triton X－100 37℃ 处理30 min，滴加10%正常马血清室温孵育1h封闭无关抗原，切片入一抗即兔抗人神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs，Millipore Corporation，CA，USA；1∶50）多克隆抗体4℃ 孵育24h，PBS充分漂洗后，入二抗即羊抗兔－CY3（goat anti rabbit－CY3，1∶600，Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA）中室温孵育1h。阴性对照以PBS代替一抗。4＇，6－二脒基－2－苯基吲哚（DAPI，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）用于染细胞核。

5.海马内肿胀轴突定量观察

从5组左脑连续系列切片中选取各组中的每第六张用于系统测定。Leica DMI 6000 B显微镜（Leica DFC 340 FX，Heerbrugg，Germany）视野下（10×5），对每张切片的整个海马区内的所有可见SACs进行记数观察，每个左脑所有切片包含的SACs总数除以所有切片数的均值代表每只小鼠海马内SACs数目（number of SACs）。

6.数据的统计分析

所有数据以均数±标准误来表示。采用非参数Kruskal－Wallis H 检验、Mann－Whitney U 检验、方差分析和多重比较。P＜0.05为差异有显著性意义。

结 果

1.年龄增长对海马内肿胀轴突丛的影响

关于老龄的GRK5KO小鼠出现AD样的病理改变，先前已经用Campbell－Switzer银染法、免疫荧光染色和电镜等方法进行了证明［3，4，8］。其最初的病理改变是海马内轴突缺陷，表现为SACs和突触蛋白数量的显著降低。本研究中，我们用抗NFT的IF染色显示不同年龄组小鼠海马内出现了结构呈蔟状分布的球状体和／或线状轴突样结构，直径明显大于正常，这与我们先前报道的一致［3，4，8］。即这些结构代表着SACs。在GRK5KO基因型小鼠组，5－6月已经开始出现SACs，而在 WT型小鼠中，7月也开始出现SACs，而且所有小鼠海马内SACs随着年龄增长逐渐增多（图1，2）。在考虑年龄增长对海马内SACs形成和积累的影响时，我们忽略了基因型因素，在不同年龄段将WT和GRK5KO小鼠的数据进行了合并，发现7－9、12－13、18－19月小鼠海马内SACs较5－6月小鼠均显著增高（P＜0.01或P＜0.001）；12－13、18－19月小鼠海马内SACs较7－9月龄小鼠均显著增高（P＜0.05或P＜0.01）（图2A）。而在WT和GRK5KO小鼠组内随着年龄增长，其海马内SACs也逐渐增加，出现类似改变（图2B）

图1 不同年龄段小鼠海马内NFT＋肿胀轴突丛的变化图中呈蔟状分布的红色部分为NFT＋SACs（白色箭头所示），蓝色部分为DAPI所染的细胞核。图E所示的标尺为100μm，适用于图 A－F。Fig.1 The changes of swollen axonal clusters in hippocampus in 5－，12－，18－month－old female mice.Representative IF results with anti－NFT staining（red）in hippocampus in WT（A，C，E）and GRK5KO（B，D，F）mice（white arrow）.Blue indicates reference DAPI staining of nuclei.Scale bar in panel E is for panels A－F：100μm.

图2 不同年龄段小鼠海马内NFT＋肿胀轴突丛数量变化与5－6月比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001；与7－9月比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与12－13月比较，＄P＜0.05。Fig.2 The quantities of NFT＋SACs in hippocampus in different aged mice.Compared with 5－6 mon group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001；compared with 7－9 mon group，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；compared with 12－13 mon group，＄P＜0.05.

2.GRK5基因缺陷对海马内肿胀轴突丛的影响

当忽略年龄因素仅仅考虑GRK5基因缺陷对海马内SACs的影响时，我们将WT和GRK5KO小鼠各自组内不同年龄段数据进行了合并，发现所有GRK5KO小鼠海马内NFT＋SACs数量较WT型小鼠显著增加（P＜0.01）（图3）。

图3 GRK5KO小鼠海马内NFT＋肿胀轴突丛较WT型小鼠明显增加与WT型小鼠比较＊＊P＜0.01。Fig.3 Increased number of NFT＋SACs in hippocampus of GRK5KO mice.Compared with WT mice，＊＊P＜0.01.

3.老化和GRK5基因缺陷促进了海马内肿胀轴突丛的形成与积累

在考虑老化和GRK5基因缺陷双因素对海马内SACs的形成与积累的影响时，我们用双因素方差分析分别比较了青壮年（5－9月）和老龄（12月龄及以上，12＋月）WT和GRK5KO小鼠海马内NFT＋SACs的变化，结果显示遗传性GRK5缺陷和老化双因素对海马内NFT＋SACs的影响有显著协同效应P＜0.01（图4），提示老化和GRK5基因缺陷促进了海马内肿胀轴突丛的形成与积累。

图4 老化和GRK5基因缺陷共同促进了海马内肿胀轴突丛的形成与积累双因素方差分析显示遗传性GRK5缺陷和老化双因素对海马内NFT＋SACs的影响有显著协同效应（P＜0.01）。与5－9 mon GRK5KO小鼠比较，＊＊＊P＜0.05；与12＋ mon WT型小鼠，＃＃＃P＜0.01。Fig.4 Aging factor synergistically interacts with GRK5 deficiency in promoting the formation and build－up of SACs.Twoway ANOVA revealed a significant interaction between age and GRK5 genotype（P＜0.01）in boosting the number of SACs in the aged female GRK5KO mice.Compared with 5－9 mon GRK5KO mice，＊＊＊P＜0.05；compared with 12＋mon WT mice，＃＃＃P＜0.01.

讨 论

海马是学习记忆的关键部位，也是发生衰老变化的最早部位。海马内轴突缺陷则是目前已知的AD最早期的病理改变［10－12］。在先前研究中我们发现17－19月龄GRK5KO小鼠即开始出现选择性工作记忆能力的损害，我们还发现在其记忆障碍的同时，相伴出现的海马内SACs较相同年龄段WT小鼠明显增加［3］，这些 SACs可被 Campbell－Switzer银染、抗轴突特异性标记物（KHC）和抗NFTs的IF染色所标记，表现为海马内出现了大量呈蔟状分布的球状体和／或线状轴突样结构，直径明显大于正常［3，4，8］。而海马内一旦大量 SACs的形 成、神经轴突退变加剧，损伤已经是不可逆性。因此确定GRK5KO小鼠海马内出现SACs最早时间点，了解GRK5基因缺陷与年龄增长的交互作用对海马内SACs形成与积累的相关性，之后对其进行早期有效的干预治疗，这对AD的防治具有重要意义。为了阐明这一问题，我们观察了不同年龄组WT和GRK5KO小鼠海马内NFT＋SACs的变化，结果发现，在GRK5KO小鼠组内，5－6月海马内已经开始出现SACs，这种病理改变明显早于认知功能障碍，而且随着年龄增长SACs明显增多，这与AD经典动物模型和病人脑内早期即有轴突缺陷的报道一致［12］，提示轴突转运缺陷可能是AD的致病因素。但另一方面我们还发现在WT小鼠中，7月也开始出现SACs，说明小鼠海马内SACs并不是GRK5KO小鼠所特有的。

我们忽略了基因型因素，在不同年龄段将WT和GRK5KO小鼠的数据进行了合并，发现所有小鼠海马内SACs随着年龄增长逐渐增多，并呈现出显著性改变；而在WT和GRK5KO小鼠组内随着年龄增长，其海马内SACs也逐渐增加，出现类似改变，这些结果证实老化加速了海马内SACs的形成与积累。

当忽略年龄因素仅仅考虑GRK5基因缺陷对海马内SACs的影响时，我们将WT和GRK5KO小鼠各自组内不同年龄段数据进行了合并，发现所有GRK5KO小鼠海马内NFT＋SACs数量较WT型小鼠显著增加。这一结果证实GRK5基因缺陷是引起GRK5KO小鼠海马内SACs显著增多的重要原因。

另外我们还比较了青壮年和老龄WT和GRK5KO小鼠海马内NFT＋SACs的变化，发现老龄的GRK5KO小鼠海马内NFT＋SACs较同龄的WT小鼠明显增多，且显著高于青壮年GRK5KO小鼠。双因素方差分析显示遗传性GRK5缺陷和老化双因素对海马内NFT＋SACs的影响呈现协同效应，提示老化和GRK5基因缺陷共同促进了海马内SACs的形成与积累。老龄WT小鼠随着年龄老化，其海马内SACs较青壮年也有所增加，但在数量上远低于老龄GRK5KO小鼠，这在一定程度上解释了为何老龄WT小鼠没有出现学习记忆障碍，而GRK5KO小鼠出现学习记忆障碍的原因。

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