ABRA在不同年龄大鼠腰段脊髓中的表达变化

刘丽华 伍校琼 杨宝林 关莹露 简晓红 朱 武 蔡维君＊？剼？

（1中南大学基础医学院组织学与胚胎学系，长沙410013；2中南大学基础医学院人体解剖学与神经生物学系，长沙410013；3湖南师范大学医学院护理系，长沙410013）

ABRA（Actin binding Rho activator）也称为STARS（striated muscle activator of Rho signaling）与MS1（Myocyte Stress－1），是近年 Arai等人首先在心脏发现的一种结合在肌小节I带的43 kD的肌动蛋白结合蛋白（actin－binding proteins，ABPs），能激活Rho信号，使肌动蛋白单体（G－actin）与肌动蛋白丝（F－actin）结合增加，从而增强肌动蛋白的多聚化，并对多聚化形式的actin有稳定作用［1－4］。其C末端含有两个独立的F－actin结合区域 （ABD1／ABD2），具有肌动蛋白结合功能［5］。Kuwahara等研究发现ABRA参与了心肌肥大与心肌病的病理过程［6］，Lamon等发现在阻力训练引起的骨骼肌肥大中，ABRA表达上调［7］，Troidl等发现提高侧支血管ABRA的表达能明显地促进侧支血管的快速生长［4，8］。这些研究表明ABRA参与调节actin的功能，增强actin的多聚化，从而对心肌、骨骼肌、平滑肌细胞的功能具有重要的作用。最近，我们课题组发现ABRA在神经系统中也有表达，提示ABRA在神经系统亦具有一定的作用［9］。脊髓神经元的分化演变，生长发育过程受各种理化因子或相关蛋白的调节与控制，如角蛋白、神经细丝蛋白等［10］。作为ABPs新加入的成员之一，ABRA是否对脊髓的生长发育具有一定作用呢？此前，ABRA在不同年龄大鼠脊髓中表达未见相关报道。为此，本研究运用Western blot及免疫荧光术检测ABRA在不同年龄阶段大鼠腰段脊髓的表达变化，为进一步研究其在脊髓中的功能活动提供形态学基础。

材料和方法

1.材料

不同年龄阶段正常SD大鼠（中南大学湘雅医学院实验动物中心提供）共计36只，雄雌不限，新生鼠（生后7d）、成年鼠（6m）、老年鼠（20m）各 12只。其中不同年龄阶段的各6只用于蛋白质提取，其余用于免疫组织化学检测。所有动物的实验处理过程，均按中南大学实验动物操作规则进行。

2.方法

2.1 Western blot检测

不同年龄阶段大鼠腹腔麻醉后，在冰上将各组腰段脊髓（L4－L6）迅速取出，称重后，以100 mg／ml加入组织裂解液（1∶100加入蛋白酶抑制剂），冰浴匀浆。以1℃，12000转／分钟离心20min左右，吸取上清，以BCA法进行蛋白定量，沸水中煮沸变性，冷却后置4℃保存。分别取不同年龄阶段腰段脊髓组织蛋白样品各40μg，行SDS－PAGE（分离胶浓度为10%）电泳，后进行湿式电转移。转移后的NC膜（Millipore公司）用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭90min，兔ABRA多克隆抗体 （1∶200，sigma，美国）和鼠GAPDH抗体室温孵育1 h后，4℃过夜，然后转入 HRP－羊抗兔IgG（1∶2000）和HRP－驴抗鼠IgG（1∶1000）中，室温孵育2h，每次抗体孵育后均用TBST漂洗10min×3次，ECL发光，显影，定影。免疫印迹照片用激光扫描仪扫描成图片后用Image－pro plus（IPP）6.0软件分别测定各蛋白条带的光密度（OD）值，以ABRA条带的OD值与相应内参GAPDH条带的OD值比值表示ABRA蛋白相对量。

2.2 灌注取材和切片准备

将实验用大鼠，以10%水合氯醛溶液经腹腔注射（4mg／kg）麻醉成功后，剪开胸腔，显露心脏，从左心室插管至主动脉，剪开右心耳。快速灌注生理盐水，待流出的液体清亮后，再灌注4%多聚甲醛固定。取腰段（L4－L6）脊髓放入4%多聚甲醛溶液中后固定，常规梯度浸糖至组织块沉底后取出，OCT复合物包埋，用三顿冷冻切片机连续切片，片厚15μm。

2.3 免疫荧光组织化学显色

组织切片用5%BSA封闭1h后同时加入一抗兔来源ABRA多克隆抗体 （1：50，sigma，美国）与小鼠来源 Neu N单克隆抗体（1：2000，sigma，美国），4℃过夜，然后加入生物素化羊抗兔IgG（1：200，sigma，美国）及偶联荧光素Cy3的驴抗鼠IgG（1：200，sigma，美国），室温孵育2 h，再加入链霉亲和素偶联的荧光素 Cy2（1：500），室温孵育lh，其中除5%BSA封闭之外，其余每次抗体孵育后均用0.01mol／L PBS洗3次，每次10min。

阴性对照用PBS代替一抗，其余各步骤均同，以排除二抗的非特异性染色。

Nikon荧光显微镜观察并拍照，图片用EZ－C1 3.70 FreeViewer进行处理。

2.4 统计学处理

结 果

1.ABRA在不同年龄阶段腰段脊髓中的蛋白水平表达变化

Western blot结果显示，与成年组、老年组比较，新生组大鼠腰段脊髓中的蛋白表达水平最高，差异具有统计学意义（P＜0.05），成年组与老年组比较差异无统计学意义，有代表性的印迹条带及至少三次重复实验光密度扫描后统计结果 （见图1）。

2.ABRA在不同年龄阶段腰段脊髓中的细胞定位

在腰髓前角，ABRA广泛表达于神经元的胞核、胞浆和突起，与前角运动神经元存在共定位（图2、图6）。阳性细胞计数显示：与成年组（0.33±0.05）、老年组（0.36±0.02）比较，新生鼠（0.18±0.03）ABRA＋Neu N双阳性细胞占总ABRA阳性细胞百分比最低，差异具有统计学意义（P＜0.05），成年组与老年组比较差异无统计学意义（图3）。

在腰髓后角，ABRA与小的Neu N（神经元标记物）阳性感觉神经元存在共定位，也主要表达在神经元胞核、胞浆和突起内（图4）。阳性细胞计数显示：与成年组（0.67±0.06）、老年组（0.71±0.05）比较，新生鼠（0.40±0.04）ABRA＋Neu N双阳性细胞占总ABRA阳性细胞百分比最低，差异具有统计学意义（P＜0.05），成年组与老年组比较差异无统计学意义（图5）。

讨 论

ABRA是2002年Arai等使用差异基因筛选独自鉴定的表达在小鼠胚胎心脏的新基因［1］以及Mahadeva等利用分子索引鉴别的在左心室负荷过大下的调节基因［2］，随后的研究发现ABRA还参与了心肌肥大、骨骼肌肥大的病理过程及侧支血管生长，ABRA通过参与调节actin的功能，增强actin的多聚化，对心肌、骨骼肌、平滑肌细胞的功能起重要的作用［4，6－8］。

我们课题组前期研究显示ABRA在神经系统中广泛表达，ABRA可见于神经元的胞核、胞浆、突起内，提示ABRA可能在神经系统中具有一定的作用［9］。在本实验中我们对各年龄组腰段脊髓ABRA的表达进行了观察，并发现不同年龄阶段大鼠腰段脊髓中均检测到ABRA的表达，且在不同年龄阶段表达有变化，新生大鼠腰髓中ABRA蛋白水平表达最高，成年鼠及老年鼠表达下调且维持在一定的生理水平，推测ABRA作为ABPs新成员之一，可能与神经细胞内其他ABPs一样，如profilin［11］、tropomysin［12］等，通过调节actin丝的形态、长度，影响神经细胞的生长、迁移及形态的改变，进而影响器官的发育，伤口的愈合等［13－15］。ABRA在新生大鼠腰髓中表达最强，这可能与大鼠发育早期神经系统发育分化等有关，至成年及老年仍维持在一定的生理水平，可能与ABRA参与调节actin的多聚化，维持成熟神经元结构功能的稳定性有关的。

本实验中免疫荧光染色显示ABRA广泛分布于各年龄组前角运动神经元，推测ABRA可能与腰段脊髓前角运动神经元的发育分化和出生后长期的神经元生存维持作用有关。在后角，ABRA高表达于感觉神经元，提示ABRA可能与外周感觉传入有关。新生鼠ABRA＋Neu N双阳性细胞占总ABRA阳性细胞百分比显著低于成年组、老年组，提示ABRA在大鼠发育早期不仅表达在神经元内，可能还表达于非神经元细胞内，共同影响大鼠的神经系统发育。

目前，有关ABRA与神经系统发育的研究只是刚刚起步，深入研究ABRA与神经系统发育的关系对于重新认识ABPs在神经系统的发育作用及进一步阐述相关疾病的机制具有重要意义，本文的结果为探讨ABRA在发育期腰段脊髓中的作用提供了一些形态学证据。ABRA在腰段脊髓表达及随发育时段而变化的事实提示ABRA可能参与腰段脊髓的发育成熟、突触的形成以及神经可塑性调节过程。

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图 版 说 明

图1 Western blot检测ABRA在新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓中的表达变化1.新生鼠2.成年鼠3.老年鼠。GAPDH作为上样对照。＊与成年鼠、老年鼠组相比P＜0.05。

图2 免疫荧光双标显示ABRA在新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓前角中的分布A－A"：ABRA（绿）和 Neu N（红）在新生鼠腰段脊髓前角的双标记B－B"：ABRA（绿）和 Neu N（红）在成年鼠腰段脊髓前角的双标记C－C"：ABRA（绿）和 Neu N（红）在老年鼠腰段脊髓前角的双标记Bar＝50μm 绿：ABRA 红：Neu N

图3 新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓前角中ABRA＋Neu N双阳性细胞占总ABRA阳性细胞百分比

＊与成年鼠、老年鼠组相比P＜0.05

图4 免疫荧光双标显示ABRA在新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓后角中的分布

A－A”：ABRA（绿）和 Neu N（红）在新生鼠腰段脊髓后角的双标记

B－B”：ABRA（绿）和 Neu N（红）在成年鼠腰段脊髓后角的双标记

C－C”：ABRA（绿）和 Neu N（红）在老年鼠腰段脊髓后角的双标记

Bar＝50μm 绿：ABRA 红：Neu N

图5 新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓后角中ABRA＋Neu N双阳性细胞占总ABRA阳性细胞百分比

＊与成年鼠、老年鼠组相比P＜0.05

图6 ABRA亚细胞定位图

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of ABRA during the lumbar spinal cord of newborn、adult and aged rats by Western blot 1，newborn rats；2，adult rats；3，aged rats.GAPDH served as a loading control.＊P＜0.05 vs adult and aged rats groups

Fig.2 Immunofluorescence double staining showed that the distribution of ABRA in the lumbar spinal cord anterior horn of newborn、adult and aged rats A－A"：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord anterior horn of newborn rats B－B"：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord anterior horn of adult rats C－C"：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord anterior horn of aged rats Bar＝50μm green：ABRA red：Neu N

Fig.3 The percentage of ABRA＋Neu N double positive cells to total ABRA positive cell in the lumbar spinal cord anterior horn of newborn、adult and aged rats Note：＊P＜0.05 vs adult and aged rats groups

Fig.4 Immunofluorescence double staining showed that the distribution of ABRA in the lumbar spinal cord dorsal horn of newborn、adult and aged rats A－A”：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord dorsal horn of newborn rats B－B”：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord dorsal horn of adult rats C－C”：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord dorsal horn of aged rats

Fig.5 The percentage of ABRA＋Neu N double positive cells to total ABRA positive cell in the lumbar spinal cord dorsal horn of newborn、adult and aged rats

Note：＊P＜0.05 vs adult and aged rats groups Fig.6 Subcellular location map of ABRA