模拟失重对大鼠血液电阻抗谱影响的实验研究

宫 宇 沈 斌 陈 林 方 云 马 青

（宁波大学医学院，宁波 3 15211）

引言

在失重环境下，机体生理机能会受到一定的影响，其中血液系统主要发生如下变化：血容量减少［1］，红细胞、血红蛋白量减少［2］以及血液流变性的改变［3］。血液系统的这些变化或多或少影响宇航员的健康与工作。因此，对失重血液学的研究十分必要。但是，受宇航员数量、实验条件、设备等诸多因素的限制，在地面通常采取大鼠尾部悬吊模拟失重的方法进行相关研究［4］。以往的模拟失重方法多集中于运动系统［5］、生殖系统［6］、基因表达［7］、心血管系统［8］等方面的研究。缺少模拟失重条件下血液电阻抗特性的研究，尤其是利用RC等效电路模型探讨血液电学性能变化。美国和前苏联航天员飞行后红细胞和血红蛋白含量的监测表明：短期飞行6～10 d即出现红细胞质量和血红蛋白含量降低，飞行40～60 d下降最多［9］，由此采用60 d尾部悬吊模拟失重。利用大鼠模拟失重模型和血液等效电路模型，研究模拟失重引起血液电学参数（电阻率和电容）变化的电生理机制，为研究模拟失重导致其他组织细胞电特性改变奠定方法学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

采用雄性SD大鼠12只，鼠龄为6～8周，体重为210～240 g，由宁波大学实验动物中心提供。按体重质量匹配原则随机将动物分成对照组（control，CON）和尾部悬吊组（tail suspension，SUS），每组各6只。

1.1.2 主要试剂及仪器

氨基甲酸乙酯（CP，国药集团化学试剂有限公司，中国）；4294A阻抗分析仪（Agilent Technologies公司，美国）、5415D/5415R离心机（Eppendorf公司，德国）、Haematokrit 210离心机（HETTICH公司，德国）。

1.2 大鼠模拟失重实验

210～240 g雄性SD大鼠12只。SUS组6只大鼠先在吊尾鼠笼内适应性饲养5 d后，再实施尾部悬吊实验。SUS组大鼠在吊尾期间，始终保持前肢与笼底接触，后肢悬空不负重，身体长轴与水平面成30°的状态。建模时间为60 d。CON组大鼠不做任何处理，在同一环境下饲养，可在笼中自由活动。两组动物均可自由饮水和进食。

1.3 血液采集

吊尾模拟失重结束时，SUS组和CON组大鼠均经20％氨基甲酸乙酯（5 mL/kg体重）腹腔麻醉，颈动脉采血3～5 mL，置于抗凝管中，待电阻抗谱测量。

1.4 电阻抗谱测量

电阻抗谱测量系统由Agilent 4294A阻抗分析仪、42942A适配器、16192A夹具和台式计算机构成。在0.01～100 MHz范围选取80个频率点，每个频率点均测量电阻抗幅模（modulus，|Z|）和相位角（phase angle，φ），得到大鼠血液阻抗的实部ReZ=|Z|cosφ和虚部Im Z=|Z|sinφ。其复阻抗Z=|Z|×e－jφ=ReZ+jImZ。每个频率点自动循环扫描进行3次测量，取其均值。交流激励信号0.5 V，测量温度为室温（25±1）℃。测量池（measuring cell）由透明的有机玻璃圆管两侧各嵌入两平行圆型铂片（Pt电极）制成（见图1）。测量池规格：直径d=13 mm，电极间距l=10.4 mm，面积S=132.66mm2，容积1.38 mL。每个血液样本测量在1 min内完成。

图1 测量池示意图Fig.1 Schematic diagram of measuring cell

1.5 血细胞压积测量

取阻抗测量后的部分血液注入比容管（长度75 mm，外径1.5 mm），用Haematokrit 210微量血液离心机以9 000 r/min，离心10 min，分别测量全血长度（L）与红细胞长度（λ），计算血细胞压积 H ct=（λ/L）×100％，又称红细胞比容（hematocrit，Hct）。

1.6 等效电路模型

图2为血液等效电路模型［10］。Ro：细胞外电阻，Co：细胞外电容，Rm：细胞膜电阻，Cm：细胞膜电容，Ri：细胞内电阻，Ci：细胞内电容。细胞三相（细胞外相、细胞膜相和细胞内相）之间关系：细胞内相与细胞膜相串联后，再与细胞外相并联。血液复阻抗Z的计算公式为

图2 血液等效电路模型Fig.2 The equivalent circuit model of blood

1.7 残差分析

残差（residual error）定义

复阻抗幅摸残差

复阻抗相位角残差

马克思、恩格斯说：“各民族的原始封闭状态由于日益完善的生产方式、交往以及因交往而自然形成的不同民族之间的分工消灭得越是彻底，历史也就越是成为世界历史。”[14]P88历史和现实已经日益证明了这个预言的科学价值。学习马克思主义这一思想，就要坚持互利共赢的开放战略，不断拓展同世界各国的合作，积极参与全球治理，同各国人民一道努力构建人类命运共同体，把世界建设得更加美好。“构建人类命运共同体”是马克思主义这一思想在当今条件下的新境界。

电阻抗实部残差

电阻抗虚部残差

复阻抗幅模对数残差：

式中，下标max表示n个频率点实测的最大值，下标min表示n个频率点实测的最小值，fit i为第i个频率点对应的拟合数值。

经计算大鼠血液电阻抗谱电路模型拟合的残差值如表1。

表1 大鼠血液电阻抗谱电路模型拟合的残差值（％）Tab.1 There sidualerror（％）of curvefitting for impedance spectra of rat blood with equivalent circuit model

1.8 曲线拟合方法及计算过程

参见阻抗分析软件Zview的使用说明书［10］。

2 结果

2.1 模拟失重对大鼠红细胞压积的影响

60 d模拟失重大鼠血液的红细胞压积（SUS组）Hct=29.86％±9.10％低于CON组Hct=38.87％±5.00％（P＜0.01），表明模拟失重致大鼠红细胞数量减少。

2.2模拟失重对大鼠血液Bode图的影响

图3是SUS组与CON组大鼠血液Bode图。图3（a）是SUS组与CON组大鼠血液电阻抗幅模|Z|与频率f的关系曲线，称为幅－频特性曲线。两组动物血液的电阻抗幅模|Z|在低频段（f＜0.1 MHz）基本稳定不变，从0.2 MHz频率开始，|Z|逐步衰减至电阻抗高频极限值，曲线呈反S型。SUS组|Z|（f）曲线相对于CON组曲线整体向下移动，使阻抗谱向低阻方向变化，导致细胞外的血浆、细胞膜和细胞内血红蛋白的电阻抗皆降低，其电路模型参数（见表2）改变：SUS组的细胞外电阻RO，SUS=185.5Ω·cm小于CON组RO，CON=216 Ω·cm；SUS组的细胞膜电阻Rm，SUS=0.015 MΩcm小于CON组Rm，CON=100 MΩcm；SUS组的细胞内电阻Ri，SUS=325 Ω·cm小于CON组Ri，CON=330 Ω·cm。幅-频特性曲线表征了模拟失重大鼠全血（细胞外、细胞膜、细胞内）电阻抗的改变。从表1残差分析可知，CON组Res（|Z|）=4.28％，SUS组Res（|Z|）=4.85％，拟合效果比较理想。

图3 模拟失重对大鼠血液Bode图的影响。（a）幅频曲线；（b）相频曲线Fig.3 Effect of simulated weightlessness on the Bode plot of rat blood.（a）amplitude-frequency curve；（b）phase-frequency curve

2.3 模拟失重对大鼠血液Nyquist图的影响

图4是SUS组与CON组大鼠血液的复阻抗平面图，亦称为Nyquist图。横轴为血液阻抗的实部Re Z=|Z|cosφ，纵轴为阻抗虚部Im Z=|Z|sinφ的负值。

图4两组曲线皆表现右侧圆弧和左侧翘尾特征［10］，右侧圆弧清晰地显示血细胞膜β色散幅度变化（ΔRe Z）。两组比较可得：1）SUS组曲线向左平移、圆弧半径减小；2）圆弧最高点为复阻抗虚部峰值Im ZP，SUS组Im ZP，SUS（26.92±9.68）低于CON组Im ZP，CON（36.21±8.24）的25.66％（P＜0.05）；3）SUS组β色散幅度ΔRe ZSUS=（82.95±24.29）Ω·cm小于CON组ΔRe ZCON=（108.61±20.34）Ω·cm的23.63％（P＜0.05）。从表1残差分析可知，CON组的Res（|ReZ|）=4.28％、Res（Im Z）=8.25％，SUS组Res（|ReZ|）=4.85％、Res（Im Z）=8.98％。

图4 模拟失重对大鼠血液Nyquist图的影响Fig.4 Effect of simulated weightlessness on the Nyquist plot of rat blood

2.4 模拟失重对大鼠血液Nichols图的影响

图5是SUS组与CON组大鼠血液的Nichols图。横轴为电阻抗模量的对数值lg|Z|，纵轴为相位角φ（弧度）的负值。此图同Nyquist图相类似。两组比较得出结果：1）SUS组曲线向左平移、圆弧面积减小；2）圆弧最高点为相位角峰值φP，SUS组数值（φP，SUS=（0.17±0.04）rad）低于CON组（φP，CON=（0.21±0.03）rad）的23.53％（P＜0.01）；3）曲线交横坐标的右截距为低频复阻抗幅摸对数（lg|Z|0）：SUS组（lg|Z|0，SUS=（2.26±0.06）Ωcm）比CON组（lg|Z|0，CON=（2.33±0.05）Ωcm）减小3.00％。从表1可知，CON组的Res（φ）=6.47％、Res（lg|Z|））=4.19％，SUS组Res（φ）=6.85％、Res（lg|Z|））=4.57％，拟合效果尚可。

图5 模拟失重对大鼠血液Nichols图的影响Fig.5 Effect of simulated weightlessness on the Nichols plot of rat blood

依据图3～图5的曲线拟合分析，得到模拟失重后大鼠血液电阻抗谱的等效电路参数，见表2。

表2 模拟失重对大鼠血液等效电路参数的影响Tab.2 The effect of simulated weightlessness on equivalent circuit parameters of impedance spectra of rat blood

3 讨论和结论

血液是最基本的组织之一，主要包括红细胞和血浆及少量的白细胞和血小板。红细胞是结构最简单的细胞，属于不均匀的电介质体系，由红细胞膜将血液分隔成三相（细胞外相-细胞膜相-细胞内相）两界面（细胞外液-细胞膜界面、细胞膜-细胞质界面），形成具有不同介电常数和电导率的结构。当外加电场作用于血液时，界面限制电荷的转移导致电荷积累，在电特性不相同的两种介质间发生了界面极化现象，称为Maxwell-Wagner效应［11］，此效应在交流电磁场作用于生物细胞时普遍存在。

随着外加电场频率的增加，血液电阻抗频谱反映细胞不同结构的电特性。当加载低频（f＜0.1 MHz）交流电场作用于血液时，电流将选择电阻抗小的血浆区域流动，绕过红细胞，在细胞外流过，故低频段血液电阻抗谱代表细胞外血浆的电阻抗特性，在图3a呈现高阻抗的电容阻断，以及图3b相位角皆接近为零的血浆电特性。随着施加于血液的外加电场频率增至中频段（f=0.1～10 MHz）时，细胞膜电容的容抗将减小，图3a呈现急剧的阻抗减小过程和图3b出现山峰变化及图4、图5出现半圆弧，故中频段血液电阻抗频谱反映血液内部红细胞膜的电学特性，呈现出细胞膜电容充放电过程，其代表性指标包括：φP、Im ZP、Δ|Z|、ΔRe Z。随着施外加电场频率增至高频段（f＞10 MHz）时，电流将穿过细胞膜流入细胞内液，在图3a表现为低阻抗的电容性短路状态，故高频段血液电阻抗频谱代表细胞内血红蛋白的电阻抗特性。也就是说，血液电阻抗频谱能够反映血液内部红细胞不同部位（细胞外、细胞膜和细胞内）的阻抗和容抗特性随电场频率的变化规律。

在模拟失重条件下，血液电阻抗谱向低阻方向移动，使SUS组全血阻抗降低，包括：细胞外血浆电阻Ro、细胞膜电阻Rm、细胞膜电容Cm、细胞内电阻Ri、细胞内电容Ci均低于对照组，表明尾部悬吊后大鼠血液电阻抗降低，其导电性能增加。其可能原因在于长期模拟失重（60 d）后，机体抗氧化物质消耗增加，抗氧化能力降低；同时伴有血液循环障碍，导致组织缺氧，自由基产生增多［12］，引起红细胞膜不稳定［13］，红细胞膜通透性增加［14］，引起细胞膜导电率增加，电阻率减低；还由于红细胞膜不稳定，产生一部分红细胞溶解［15］，再加上促红细胞生成素减少［16］，引起红细胞数量和质量下降［15］，红细胞比容（Hct）降低，导致全血导电率增加，电阻率降低。另外，在模拟失重条件下，细胞内电容Ci和细胞膜电容Cm减小的原因可能与红细胞异型性［17］以及红细胞膜流动性和变形能力下降有关［13］。

本研究主要贡献在于：利用血液等效电路模型分析了血液细胞外血浆、红细胞膜和细胞内血红蛋白的电导率和电容的降低，引起的模拟失重后血液电特性变化的电生理机制。

本研究表明，模拟失重使大鼠血液的红细胞比容（Hct）明显降低，红细胞膜电阻率显著降低，导致细胞外液和全血阻抗降低，导电性增加，阻抗谱向低阻方向移动。

血液等效电路模型对模拟失重大鼠血液电阻抗谱进行的拟合分析在低频段（f＜0.1 MHz）和中频段（f=0.1～10 MHz）拟合情况较好。在高频段，由于红细胞内血红蛋白存在δ弛豫［18］，使得实验数据与等效电路模型拟合效果不如Cole-Cole数学模型拟合效果理想［19］。但与家兔血液［20］及小鼠血液［21］相关特性相比，三者的曲线走势基本一致。经过曲线拟合建立的模拟失重后大鼠血液等效电路模型电阻抗参数，能够反映失重血液对交变电场阻抗响应的规律和血液频域电生理学数据特征，具有重要的生理意义，为失重血液生理学提供一种新的研究手段和电特性指标。为等效电路模型应用在模拟失重后其他生物细胞建模也有重要的参考价值。

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