高效液相色谱－蒸发光散射检测妥布霉素的含量

乔志华

（临汾市食品药品检验所，山西 临汾041000）

妥布霉素是具有广谱抗菌活性的氨基糖苷类抗生素，具有疗效高和毒性低的特点。氨基糖甙类抗生素没有紫外吸收，无法采用紫外检测器进行检测。其含量测定一般采用［1－3］生物效价测定法、旋光法、衍生化紫外分光光度法、高效液相色谱衍生化法、薄层色谱法等，近年来已有关于蒸发光散射检测技术分析氨基糖苷类抗生素的报道出现，而2005年版的中国药典也已收载了蒸发光散射检测技术和相关品种。本文建立高效液相色谱－蒸发光散射检测妥布霉素的含量，报道如下。

1 仪器与试剂

LC－2010 型 高 效 液 相 色 谱 仪（日 本 岛 津 公 司）；SEDEX75 型 蒸 发 光 散 射 检 测 器；VP ODS C18色 谱 柱（4.6mm×250mm，5μm）；三氯醋酸为分析纯，甲醇为色谱纯，水为蒸馏水。妥布霉素对照品含量91.4%，批号：130527－200403），新霉胺对照品，批号85－1108；卡那霉素B对照品，批号130548－20052，均为中国药品生物制品检定所提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：VP ODS C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：0.2mol／L 的三氯醋酸－甲醇（90∶10）；流速：1.0mL／min；蒸发光散射器的漂移管温度：40℃，雾化气体压力为3.5bar（高纯氮气）。

2.2 专属性考察

精密称取妥布霉素标准品、卡那霉素对照品和新霉胺标准品，分别置于100mL 容量瓶中，加水至刻度，制成浓度为1mg／mL的溶液，量取5mL 与硫酸溶液（浓度为2×10－3mL／mL）5mL混合作为混合溶液，精密量混合溶液20μL进样，记录色谱（图略）。结果显示，硫酸根（2.463min）、卡那霉素（4.395min）、新霉胺（4.286min）的色谱峰与妥布霉素（5.257min）峰的分离度分别为14.33、5.96、1.31，卡那霉素和新霉胺这两种杂质不干扰妥布霉素的测定。

2.3 线性关系考察

对照品配制：精密称取妥布霉素对照品，置于100mL容量瓶加水稀释，摇匀，制成199.45μg的溶液，分别进样20、25、35、45、50、60μL，记录峰面积。以进样量所相当浓度的对数（lgC）为横坐标，峰面积的对数（IgA）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：lgA＝1.1216lgC＋6.537 2（r＝0.999 8，n＝6）。结果，妥布霉素检测浓度的线性范围为241.3～1 867.9μg／mL。

2.4 重复性检查

供试品溶液配制：分别精密称取妥布霉素和硫酸妥布霉索适量，加水分别制成1mL／mg的溶液，摇匀，即得，平行制备6份。按随行标准曲线法计算含量，结果妥布霉素的平均含量为73.72%，RSD为0.73%；硫酸妥布霉素中妥布霉素的平均含量为62.41%，RSD 为0.79%，表明本法重复性良好。

2.5 回收率考察

精密称取已知含量的硫酸妥布霉素样品适量（分别为浓度高、中、低各3份）和与之相对应量的妥布霉素对照品9份，分别置于50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，取10μL注入液相色谱仪进行测定。计算回收率，测得回收率分别为99.9%，99.7%，99.5%。平均回收率为99.7%，RSD＝0.43%，结果显示回收率良好。

2.6 样品含量测定

取妥布霉素对照品溶液，进样，记录色谱图，以进样量所相当浓度的对数（lgC）为横坐标，峰面积的对数（IgA）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：lgA＝algC＋b；取供试品溶液，分别平行进样，测定供试品溶液主峰的平均峰面积（A），并根据对照品标准曲线计算供试品溶液中妥布霉素的浓度［10＾（19A－b）／a］，然后再根据供试品溶液的称样量，计算供试品中妥布霉素的含量。结果如表1所示，采用高效液相色谱－蒸发光散射法与生物检定法含量测定结果相似。

表1 高效液相色谱－蒸发光散射法与生物检定法含量测定结果 （%）

3 讨论

色谱条件的选择：氨基糖苷类药物为离子化合物，极性很强，故采用非衍生化的HPLC法时，通常用反相离子对色谱法进行测量。一般的离子对试剂挥发性较差，而全氟化羧酸如三氯醋酸对试剂的挥发性较好，分离效果理想，故本实验选择三氯醋酸为流动相［4］。选择溶剂时，考虑到妥布霉素及硫酸妥布霉素均易溶于水，且水又同时为流动相的主要组成部分，与流动相分别制备溶液测定时，色谱峰的各项参数接近，差异不大，故可选择水为溶剂。流动相的流速对各成分之间的分离度产生的影响不大，但如果流速过低会导致出峰缓慢、峰形扩散，流速过高又会使柱压升高。通过实验得出，选择1.0mL／min的流速时可得到较为理想的色谱行为。柱温升高可减少保留时间和增加柱效，但对色谱柱本身会产生一定的影响，减少柱子寿命，40℃为较适合的温度。检测器参数的选择：通过考察不同温度的检测结果后，发现检测器漂移管温度设置为40℃时，峰响应最大，基线也较平稳、噪音较小。而设置不同的载气压考察时，当载气压为3.5bar时，基线与色谱响应处于较合适的位置，故采用之。含量测定方法的选择：根据蒸发光散射检测器的原理，样品浓度和检测器响应之间呈指数关系，转换成对数可呈线性关系，方便计算。采用微生物检测法测定含量的结果与本文所用高效液相色谱－蒸发光散射检测结果相近，但本文方法简单，快速，更符合实验操作的要求。

本文建立的高效液相色谱－蒸发光散射检测妥布霉素的方法与其他方法相比，具有以下优点［5］：不需要进行衍生化，排除了具有与妥布霉素相近理化性质的其他氨基糖苷类化合物的干扰，减少样品前处理可能产生的误差，提高了分析准确度。

［1］ 苏藻.妥布霉素测定方法研究进展［J］.海峡药学，2004，16（4）：13.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）［S］.北京：化学工业出版社，2005：270.

［3］ 洪利娅，陈悦，陈贵斌，等.HPLC－ELSD法测定妥布霉素的含量［J］.中国抗生素杂志，2005，30（11）：662.

［4］ 陈宁林，张华艳.高效液相色谱一蒸发光散射检测妥布霉素的含量［J］.中国医院药学杂志，2007，27（9）：1248－1250.

［5］ 颜彦，王康俊.HPLC－ELSD 法测定硫酸妥布霉素注射液含量［J］.中国热带医学，2007，7（9）：1674－1675.