不同采收期菝葜中黄酮类成分含量动态变化的研究

李凤娟，周日宝*，刘湘丹，刘笑蓉，王朝晖，孙梦姗

（湖南中医药大学 湖南 长沙 410208）

不同采收期菝葜中黄酮类成分含量动态变化的研究

李凤娟，周日宝*，刘湘丹，刘笑蓉，王朝晖，孙梦姗

（湖南中医药大学 湖南 长沙 410208）

目的 以黄酮类含量为指标，确定菝葜根茎药材的最佳采收期。方法 以芦丁为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定不同采收期菝葜根茎中总黄酮含量，并采用HPLC测定其中落新妇苷和黄杞苷的含量。结果 11月中旬以前总黄酮含量明显低于11月中旬以后；10～11月初随着生育期延长菝葜根茎中总黄酮含量略有下降，11月份以后菝葜根茎中总黄酮含量不断积累，至12月底菝葜进入休眠期后菝葜根茎中总黄酮的含量最高，达3.0%±0.1%。菝葜根茎药材中落新妇苷和黄杞苷的总含量大于0.10%，符合2010版《中华人民共和国药典》的规定，在12月底含量达到最大值。结论 菝葜药材的最佳采收期应为菝葜地上部位落叶枯萎，根茎进入越冬休眠期后采收。

菝葜；黄酮类成分；含量测定；紫外-可见分光光度法；HPLC；不同采收期

菝葜系百合科菝葜属植物，主要分布于我国长江以南地区，其根茎、叶均可入药，尤以根茎为大宗常用中药。菝葜根茎主要包含皂苷类、黄酮类、鞣质类等[1-2]多种化学成分，具有利湿去浊、祛风除痹、解毒散瘀等药理活性[3]，性甘、酸、平、温。为了更好地了解菝葜药材的最佳采收期，现采用紫外-可见分光光度法测定不同采收期菝葜根茎中总黄酮的含量，同时以落新妇苷和黄杞苷为指标，采用RPHPLC测定同一地区不同采收期菝葜根茎中两种成分的含量，以期为野生抚育基地菝葜根茎药材最佳采收期的确定提供实验依据。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；101-3AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；FA2004型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；752pc型紫外-可见分光光度计 （上海光谱仪器有限公司）；Agilent Technologies 1200series（美国进口）。

1.2 试验试剂

甲醇为色谱纯；其它试剂为分析纯；芦丁对照品（中国药品生物制品研究所，批号：10080-200707）；落新妇苷对照品、黄杞苷对照品（天津马克生物技术有 限 公 司 ， 批 号 ：TFL-1-20110226、TFL-2-20110226，纯度 98.5%)；超纯水为自制。

1.3 样品材料

样品材料采自湖南省平江县菝葜药材野生抚育基地，经湖南中医药大学周日宝教授鉴定为菝葜Smilax china L.的根茎。供试品：取上述菝葜根茎洗净，于60℃烘干，粉碎并过40目筛后，装入塑料封口袋中备用。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取于120℃干燥至恒质量的芦丁对照品10.0mg，置100 mL量瓶中，加入70%乙醇50 mL，置温水中加热使溶解，放冷，加70%乙醇定容，摇匀，即得0.100mg/mL的芦丁对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取供试品约3 g，精密称定，加70%乙醇90 mL，超声提取3次，每次1 h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至滤液100 mL以下，用70%乙醇定容于100 mL量瓶中，精密吸取续滤液10 mL，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，移入分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取5次，每次10 mL。合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣用70%乙醇溶解并定容至50 mL。

2.1.3 测定波长的确定 取对照品溶液和供试品溶液各3 mL，分别置10 mL量瓶中，加乙醇2 mL，加5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠4 mL，加乙醇至刻度，摇匀，放置 15min，于 400～700 nm处扫描，结果对照品和供试品溶液在495 nm处均有较强吸收峰（见图1）。故选择测定波长为495 nm。

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置10mL量瓶中，按“2.1.3”项下方法显色，于495 nm测定吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。回归方程：

在 0.010～0.060mg/mL范围内，浓度与吸光度具有良好线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密吸取同一芦丁对照品溶液3 mL，按“2.1.3”项下方法显色，连续测定6次，测定吸光度，RSD=0.60%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1.3”项下方法显色， 分别在 0、15、30、45、60、120min 时测定其吸光度。结果表明在显色后15～60min其吸光度的RSD为2.7%，表明供试品溶液宜在显色15min后开始测定，并于60min内完成测定。

2.1.7 重复性试验 取同一批供试品 （采收期为2010.11.01）6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下方法显色测定，用回归方程计算含量。结果菝葜中总黄酮平均含量为2.06%，RSD为1.6%（n=6）。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知总黄酮含量的菝葜根茎药材粉末 （采收期为2010.11.01）0.5 g，共5份，分别精密加入一定量的芦丁对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下方法显色测定含量，计算回收率，结果见表1。

2.1.9 含量测定 取不同采收期的菝葜供试品，按“2.1.2”和“2.1.3”项下方法操作，计算供试品中总黄酮的含量，结果见表2。

表1 加样回收率实验结果 （mg，n=5）

表2 不同采收期菝葜根茎药材中总黄酮、落新妇苷和黄杞苷含量（，n=3，mg/g）

表2 不同采收期菝葜根茎药材中总黄酮、落新妇苷和黄杞苷含量（，n=3，mg/g）

样品采收期 总黄酮含量 落新妇苷含量 黄杞苷含量 落+黄总含量2010.10.01 20.667±0.335 1.117±0.010 6.927±0.017 8.044±0.0272010.10.11 25.687±0.273 1.355±0.015 8.010±0.057 9.365±0.0692010.10.21 24.424±0.501 0.748±0.012 3.642±0.018 4.390±0.0302010.11.01 20.627±0.263 0.854±0.006 3.696±0.016 4.550±0.0222010.11.11 26.778±0.350 0.614±0.006 4.192±0.012 4.806±0.0182010.11.21 27.674±0.474 1.434±0.014 6.544±0.064 7.978±0.0782010.12.01 29.365±0.441 1.392±0.011 7.833±0.027 9.225±0.0382010.12.11 29.909±0.670 1.213±0.013 6.141±0.046 7.354±0.0592010.12.21 29.959±0.490 1.114±0.013 6.778±0.025 7.892±0.0382011.01.01 31.385±0.639 1.917±0.01812.309±0.02314.226±0.0412011.01.11 30.059±0.375 1.678±0.022 7.837±0.057 9.515±0.079

2.2 落新妇甘和黄杞苷含量的测定

2.2.1 色谱条件[3]色谱柱Apollo C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（40∶60）；流速为 1 mL/min；检测波长为 290 nm；柱温为35℃。在上述色谱条件下，分别取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入色谱仪，对照品及样品溶液的HPLC色谱图如图2和图3所示。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取落新妇苷、黄杞苷对照品适量，用甲醇定容，分别制成0.04mg/mL落新妇苷对照品溶液和0.3mg/mL的黄杞苷对照品溶液，再分别精密吸取落新妇苷和黄杞苷对照品溶液25 mL于50 mL容量瓶中，摇匀，制成混合对照品溶液。

2.2.3 供试液的制备 取本品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理 （功率250 W，频率40 kHz）45min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取落新妇苷和黄杞苷对照品溶液 1、2、3、5、10、20 μL 进样， 测定落新妇苷和黄杞苷峰面积，以峰面积为纵坐标，以进样量（μg）为横坐标，得到落新妇苷的回归方程为Y=2523.6X-0.1067，r=1.0000，黄杞苷的回归方程为Y=3721.6X-0.1058，r=1.0000。落新妇苷和黄杞苷分别在 0.02～0.40 μg 和 0.15～3.01 μg 范围内具有良好的线性关系。

2.2.5 样品含量测定 采用上述色谱条件，对菝葜样品进行测定，按外标法以峰面积计算落新妇苷和黄杞苷的含量。结果见表2。

3 讨论

对来自湖南省平江县野生抚育基地的11批不同采收期菝葜根茎中总黄酮含量的动态变化进行分析可知，不同采收期菝葜根茎中总黄酮含量较高，均在2.0%以上，11月中旬以前总黄酮含量明显低于11月中旬以后；10月至11月初随着生育期延长，总黄酮含量略有下降，11月份以后总黄酮含量不断积累，至12月底菝葜进入休眠期后菝葜根茎中总黄酮的含量最高，达3.0%以上，后期总黄酮含量的不断增加，可能是地上部分茎叶中的黄酮不断运输至地下根茎中不断积累的结果。菝葜药材的最佳采收期应为地上部位落叶枯萎，根茎进入越冬休眠期后采收，与传统的采收方法一致[3]。

湖南省平江县菝葜药材野生抚育基地不同采收期菝葜根茎中落新妇苷和黄杞苷的总含量远远超过了2010版 《中国药典》的规定标准 （总量不少于0.10%），此外，笔者还对菝葜样品进行了水分、灰分、浸出物等常规测定，结果均符合2010版《中国药典》规定标准，说明该野生抚育基地生产的药材是优质的，适宜大规模开展菝葜药材的野生抚育或菝葜野生变家种的人工栽培。

[1]干国平，于伟，孙进，等.不同产地菝葜中总黄酮的含量考察[J].中国医院药学杂志，2008，28（23）：2055-2056.

[2]干国平，于伟，江维，等.菝葜化学成分的研究[J].时珍国医国药，2007，6(6)：1404-1405.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：290.

Research on dynamic changes of flavonoids contents in Smilax China L.from different harvest time

LI Feng-juan,ZHOU Ri-bao*,LIU Xiang-dan,LIU Xiao-rong,WANG Zhao-hui,SUN Meng-shan
（TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410208，China）

Smilax China L.； flavonoids； quantitative determination； ultraviolet-visible spectrophotometry； HPLC； different harvest time

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.11.010.038.04

〔Absrract〕Objective To determine the optimum harvest time of Smilax China L using the flavonoids content as an index.Methods The content of total flavonoids in Smilax china L.was determined by ultraviolet-visible spectrophotometry with rutin as standard control，and astilbin and engeletin in SmilaxChinaL.weredetermined usingHPLC method.ResultsThetotal flavonoids content of Smilax China L.harvested before the mid-November is markedly lower than that of harvested after the mid-November. As the growth period extending，the total flavonoids content in the rhizome of Smilax China L.gradually reduced from October to the begin ning of November，but the flavonoids content constantly accumulated after November and reached the peak when the rhizome of Smilax China L.entered hibernation at the end of December，which is 3.0%±0.1%.The total content of astilbin and engeletin in the rhizome of Smilax China L.was more than 0.10%，which complied with the quality standards in the 2010 edition of the China pharma copoeia，and the content reached the peak at the end of December.Conclusion The Smilax Chi na L.may be collected atthe time thatSmilax China L.leaves has fallen and the above-ground has withered，and the rhizome has entered winter hibernation.

2012－07－21

湖南省教育厅高校创新平台开放基金（09k061）；湖南省中医药管理局（2009010）。

李凤娟（1986-），女，河南周口人，在读硕士研究生，主要从事中药资源与质量研究。

* 周日宝，男，博士研究生导师，E-mail：zhouribao20032003@yahoo.com.cn。

（本文编辑 杨 瑛）