微藻叶绿素荧光技术在环境监测中的应用

姜恒，吴斌 ，阎冰，吴志强，邢永泽

1.桂林理工大学，广西 桂林 541004

2.广西红树林研究中心，广西 北海 536000

叶绿素荧光技术是一种以光合作用理论为基础，利用生物体内叶绿素研究和探测生物光合生理状况及各种外界因子对其细微影响的新型生物活体测定和诊断技术。其具有测定快速、灵敏，对细胞无损伤的优点，是研究生物光合作用的理想方法［1］。

微藻是海洋的初级生产者，是海洋食物链的基础，对于海洋生态的平衡和稳定具有不可替代的作用，光合作用是微藻最敏感的生理过程之一，环境因子的胁迫作用主要破坏光系统Ⅱ(PSⅡ)，而胁迫作用对PSⅡ的破坏可以通过叶绿素荧光参数的变化反映出来。目前主要是研究微藻在光照、温度、pH、N、P、化学物质、重金属等胁迫条件下叶绿素荧光参数的变化。

1 叶绿素荧光技术中常用的参数

F0指初始荧光(minimal fluorescence)，其大小主要取决于PSⅡ天线色素内的最初激子密度、天线色素之间以及天线色素到PSⅡ反应中心的激发能传递机率的结构状态，因此这部分荧光强度与激发光的强度和叶绿素含量有关，是纯物理过程，它与光合作用光反应无关。F指任意时间实际荧光产量(actual fluorescence intensity at any time)。Fm指最大荧光产量(maximal fluorescence)，是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量，Fm的变化反映PSⅡ的电子传递变化情况。Fv为可变荧光(variable fluorescence，Fv=Fm-F0)，反映 QA(特殊结合状态的质醌)的还原情况。Fv/Fm和Fv/F0分别表示PSⅡ的最大光化学量子产量(optimal/maximal photochemical efficiency of PSⅡ in the dark)和 PSⅡ的潜在活性。Fv/Fm和Fv/F0下降表明，胁迫使PSⅡ反应中心受损，抑制光合作用的原初反应，阻碍光合电子传递的过程。ΦPSⅡ表示作用光存在时PSⅡ的实际光能转化效率，ΦPSⅡ的降低，说明胁迫阻止藻细胞同化力(NADPH，ATP)的形成，从而影响对碳的固定与同化。rETR表示PSⅡ的相对电子传递速率(relative electron transport rate)，rETR下降表明胁迫使QA→QB(二级电子受体)的电子传递受到抑制。ETR代表相对光合电子传递速率(electronic transfer rate)。qP为光化学淬灭(photochemical quenches)，反映PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的份额。qP下降表明电子由PSⅡ的氧化侧向PSⅡ反应中心的传递受阻，用于进行光合作用的电子减少，以热或其他形式耗散的光能增加。qN即非光化学淬灭(non-photochemical quenches)，又可以写作NPQ，反映PSⅡ吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光部分，qN上升表明卡尔文循环的活性受抑制的程度增大，PSⅡ的潜在热耗散能力增强，能够有效避免或减轻因PSⅡ吸收过多光能对光和机构的损伤。当其上升到一定值后下降说明正常生理功能受到严重伤害，对热能的耗散能力丧失。Y为实际量子产量(actual quantum yield)。PSⅡ光化学有效量子产量(photochemical efficiency of PSⅡ in the light)用 Y'(Y'=Fv'/Fm')表示，代表激发能被开放的反应中心捕获的效率，它定量了由于热耗散的竞争作用而导致PSⅡ的光化学被限制的程度［2-3］。

2 环境因子对微藻叶绿素荧光的影响

2.1 光

目前光照对盐生杜氏藻影响的研究比较多［4］，White等［5］将盐生杜氏藻(Dunaliella salina)和巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)暴露于UVAR(紫外线A辐射)下，试验表明其Fv/Fm显著降低，PSⅡ光合电子传递效率部分损失，但是UVBR(紫外线B辐射)对其光合参数没有显著影响。Nilawati等［6］研究了紫外辐射对两种海洋冷水性硅藻(Pseudonitzschia seriata和Nitzschia sp.)的影响，试验表明，UVBR使这两种藻的Fv/Fm降低，PSⅡ反应中心遭到破坏。李守淳等［7］研究发现，随着UVB辐射时间的延长，南极小球藻(Chlorella vulgaris Antarctic strain)叶绿素荧光迅速下降。张丽霞等［8］在四种不同光照强度下培养铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa)，并运用叶绿素荧光仪进行测定，试验表明，铜绿微囊藻生长和进行光合作用的最适光照为40 μE/(m2·s)，强光胁迫使铜绿微囊藻的 Fv/Fm显著降低。

2.2 温度

微藻光合作用对温度比较敏感，高温可使类囊体膜的结构发生变化，这种变化首先反映在F0的上升，F0是反映微藻温度胁迫的重要指标。Sayed等［9］发现，当温度为25～35℃时，小球藻(Chlorella vulgaris)的Fv/Fm、Fm和Fv/2均随温度的升高而增大，在35～40℃时达到最大值，随后开始下降。黄仿等［10］研究了热胁迫对角毛藻(Chaetoceras sp.)的影响，发现引起该藻F0骤升的温度为49.5℃，当温度升高至45℃时，Fv/Fm和Fv迅速下降，qN显著增加。梁英等［11］研究发现，盐生杜氏藻(Dunaliella salina)的 Fv/Fm、Fv'/Fm'、ΦPSⅡ、rETR 和 qP 都随着温度和时间的增加而明显下降，qN呈先上升再下降的现象，在50℃下处理18 min后，各荧光参数均下降为 0。塔胞藻(Pyramimonas sp.)的 Fv/Fm、Fv'/Fm'、ΦPSⅡ、rETR和qP都随温度和时间的增加而下降，qN在35℃下随着时间的延长逐渐降低，在20 min时下降到0，在40℃下10 min后 qN变为0，但60 min时又升到0.48。45℃下处理18 min后，各荧光参数均下降为0。梁英等［12］通过研究发现，等鞭金球藻3011(Isochrysis galbana MACC/H59)在 35，40和45℃下处理不同时间Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ、rETR和qP都有不同程度的下降，且随处理时间的延长和处理温度的升高而下降，处理时间越长、处理温度越高，下降幅度越大。而qN是先上升到最大值，然后降低。球等鞭金藻8701(Isochrysis galbana MACC/H60)在35，40和45℃下处理不同时间Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ和rETR都有不同程度的下降，且随着温度的升高，时间的延长，下降幅度逐步增大，而qP和qN表现为先上升后下降。韩志国等［13］研究发现，纤细角刺藻(Chaetoceros gracilis)在适宜的盐度下随温度的升高Fv/Fm先有轻微的上升，随后开始逐渐下降。在两种盐度下F0均随温度的升高而升高。小球藻(Chlorella minutissima)在适宜的盐度下随温度的逐渐升高，Fv/Fm逐渐降低;而角刺藻中，出现Fv/Fm轻微升高的现象，并在中等温度(35和40℃)下缓慢降低，在高温(45和50℃)下急剧降低。两种盐度下小球藻的F0亦随温度的升高而逐渐上升。

2.3 pH

水体pH是一个重要的生态因子，藻类的光合作用与水体的pH有着密切的关系，每种藻类都有它自身适合的pH范围，改变pH会影响藻类的光合作用，使藻类生长发生变化。大多数藻类适宜在中性或弱碱性水中生活。有研究表明，酸化水体中藻类的生长潜力微弱［14］。王铭等［15］研究发现，雨生红球藻(Haematococcus pluvialis CG-l)在pH为6.0～7.5时，Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ和 ETR 随 pH 升高而增大，pH为7.5时达到最大值，pH超过7.5时，Fv/Fm和Fv/F0明显下降，而ΦPSⅡ和ETR的下降趋势不明显。李艳红等［16］发现当pH为6.0～7.0时，铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa FACHB-496)叶绿素荧光参数 Y、Y'、ΦPSⅡ、ETR和 qP逐渐减小，特别是pH为6.0时，其减小的趋势更明显。当pH为8.0～10.0 时，Y、Y'、ΦPSⅡ、ETR 和 qP 逐渐增加。

2.4 氮、磷

氮、磷是微藻生长必不可少的重要因子，氮、磷的缺乏以及氮、磷比的失衡都能限制微藻的生长。尹翠玲等［17］在5种氮浓度的培养液中培养球等鞭金藻3011(Isochrysis galbana MACC/H59)和球等鞭金藻8701(Isochrysis galbana MACC/H60)，研究叶绿素荧光参数的变化，发现球等鞭金藻3011的Fv/Fm随着起始氮浓度的增加而增加，在7040 μmol/L时达到最大值;球等鞭金藻8701的Fv/Fm随着起始氮浓度的增加而增加，在440 μmol/L时达到最大值，其后随氮浓度的增加其上述指标反而下降。梁英等［18］将绿色巴夫藻(Pavloca viridis)在不同氮浓度的培养基中进行培养发现，各浓度下的Fv/Fm、ΦPSⅡ和ETR总体呈先上升后下降的趋势，而qN和NPQ总体呈先下降后上升的趋势。在氮浓度为880 μmol/L时，上述各值显著高于其他浓度。尹翠玲等［19］将盐生杜氏藻(Dunaliella salina)和纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)在不同氮浓度的培养基中进行培养发现，两种微藻的Fv/Fm均随着起始氮浓度的增加而增加，在1760 μmol/L时达到最大值，其后随着起始氮浓度的增加，上述指标反而下降。

宋丽娜等［20］在不同浓度的磷溶液中培养海洋小球藻(Clllorella sp.)发现，Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ和ETR均先升后降，并表现出低磷组(3.62 μmol/L)显著低于其他各组，高磷组(434.52 μmol/L)一直处在较高水平。尹翠玲等［21］在不同浓度的磷溶液中培养盐生杜氏藻(Dunaliella salina)和纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)，运用叶绿素荧光技术进行测量发现，盐生杜氏藻的Fv/Fm随着起始磷浓度的增加而增加，在290.4 μmol/L处达到最大值。纤细角毛藻的Fv/Fm在18.15 μmol/L处达到最大值，而后随着磷浓度的继续升高其值反而降低。梁英等［22］研究了小球藻(Chlorella sp.)在不同磷浓度培养其叶绿素荧光参数的变化发现，Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR和qP随着起始磷浓度的增大而增大，在磷浓度为36.3 μmol/L达到最大，继续加磷瞬时荧光不断下降，PSⅡ出现瞬间的上升后恢复至原初状态，qP和NPQ则不断上升。Lippemeier等［23］研究了微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)在磷胁迫下的变化，在磷盐缺少的情况下，ΔF/Fm'前5天的变化不明显，从第6天开始下降，F和Fm'则显著升高。

2.5 化学物质

近年来在各种化学物质对藻类叶绿素荧光影响研究方面主要有:Miriam等［24］通过研究集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803)在5 mmol/L 的 NH4Cl，并在淬火光抑制下暴露12 min，发现Y下降至0。Nils等［25］将眼虫藻(Euglena gracilis)和莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)在不同浓度的草木灰溶液中培养发现，眼虫藻在10和12.5 g/L时rETR发生剧烈的变化，NPQ表现出增长;莱茵衣藻的rETR不受抑制，反而表现出促进作用，NPQ急剧增长。两种藻的 Fv/Fm、qP与 rETR的趋势相似。何艺等［26］研究披针舟形藻(Navicula lanceolata)在不同浓度的荧蒽下叶绿素荧光参数的变化，试验表明，荧蒽对Y、ETR和qP等参数有显著促进作用，并且随着浓度的升高，促进作用逐步增大;但不同浓度的荧蒽对Fv/Fm和NPQ无显著影响。杨慧丽等［27］通过在不同浓度的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)培养三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，对其叶绿素荧光参数进行测量发现，随着DBP暴露浓度的升高，Fv/Fm、Fv/F0、Y和ETR均下降。但与对照组(丙酮)相比，低浓度处理组(≤4 mg/L)各指标下降不明显，而5 mg/L的试验组在胁迫12 h后，Fv/Fm、Fv/F0、Y和ETR逐渐上升，其参数值甚至超过其他处理组。刘雷等［28］通过在不同浓度的十二烷基苯磺酸钠(LAS)下培养铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)，并对叶绿素荧光参数进行测定发现，小于0.05 mg/L的LAS对该藻未产生胁迫作用，反而能提高PSⅡ的ΦPSⅡ、qP和rETR，从而促进光合作用;在10 mg/L时Y、Y'波动较大，ΦPSⅡ、qP和rETR急剧下降后回升，qN 和 NPQ 一直下降，直至为0。Ruan等［29］在不同浓度的草甘膦下培养蓝藻葛仙米(Nostoc sphaeroides)，并测得叶绿素a浓度和Fv/Fm在最高浓度组(0.6 mmol/L)4 d后开始受到影响。冉春秋等［30-32］在不同浓度的解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)下培养海洋亚心型扁藻(Platymonas subcordiformis)、莱茵衣藻(Creinhardtii reinhardtii)发现，在光照期间PSⅡ光化学活性都降低，且CCCP的浓度越高对藻细胞PSⅡ光化学活性的抑制作用越明显，一定浓度的藻细胞具有耐受CCCP抑制PSⅡ光化学活性的能力。Anita等［33］通过研究Thalassiosira weissflogii、Emiliania huxleyi、Tetraselmis sp.、Flagellate Japonicasiz四种藻在不同浓度的Irgarol® 1051(一种海洋防污损涂料添加剂)下的培养，发现Y'的变化与藻的生长速度一致，表现为随着浓度的增加而变小。李卓娜等［34］用浓度为0.1，1.0 和2.5 μg/L 的2，2'，4，4'-四溴联苯醚(BDE-47)处理海水小球藻(Chlorella autotrophica)，在8 h后的荧光参数与对照组(0 μg/L)比较如表1所示。

表1 2，2'，4，4'-四溴联苯醚(BDE-47)处理海水小球藻试验组与对照组(BDE-47浓度为0)叶绿素荧光参数的比较Table 1 The chlorophyll fluorescence parameters comparison of the experimental group of Chlorella autotrophica processing by BDE-47 with the control group(BDE-47 concentration is 0)

由表1可见，在不同BDE-47浓度下，小球藻Fv/Fm与对照组无显著性差异;Fv/F0、ΦPSⅡ和 rETR在BDE-47浓度为0.1和2.5 μg/L时测定值均显著高于同期的对照组水平，而在1.0 μg/L时与对照组无显著差异;qP表现为与对照组无显著差异。

表2为用0.1，1.0和2.5 μg/L的BDE-47处理赤潮异弯藻(Heterosigam akashiwo)24，48和72 h后，荧光参数与对照组(0 μg/L)的变化［34］。从表2可以看出，赤潮异弯藻在BDE-47浓度为0.1 μg/L下暴露培养24 h，其 Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ和 rETR 显著高于对照组，而qP表现为与对照组无显著差异;暴露培养48 h各参数都显著高于对照组;暴露培养72 h各参数与对照组无显著差异。在BDE-47浓度为1.0 μg/L下暴露培养24 h，除Fv/Fm显著高于对照组，其余各参数均与对照组无显著差异;暴露培养48 h各参数都显著高于对照组;暴露培养72 h除qP与对照组无显著差异外，其余参数都显著高于对照组。在BDE-47浓度为2.5 μg/L下暴露培养24 h除Fv/Fm与对照组无关外其余各参数都与对照组无显著差异;暴露培养48 h各参数显著高于对照组;暴露培养72 h除qP与对照组无显著差异外，其余参数都显著高于对照组。

表2 2，2'，4，4'-四溴联苯醚(BDE-47)赤潮异弯藻试验组与对照组(BDE-47浓度为0)叶绿素荧光参数的比较Table 2 The chlorophyll fluorescence parameters comparison of the experimental group of Heterosigam akashiwo processing by BDE-47 with the control group(BDE-47 concentration is 0)

2.6 重金属

随着现代社会经济的发展，重金属污染问题越来越严重，对于重金属的研究也越来越重视，其中重金属对于藻类荧光的影响研究也颇多。Mallick等［35］运用叶绿素荧光技术研究重金属 Cu，Cr，Ni，Cd和Zn对斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)的影响发现，在12 h内，这5种重金属离子均使F0升高，Fm下降，Fv/Fm下降，qP下降和 qN上升，qN/2下降，F0/Fv显著上升。王帅等［36］研究了在不同Cd2+浓度下培养绿色巴夫藻(Pavlova viridis sp.MACC/H61)等6种藻类，并对叶绿素荧光参数Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ、rETR、细胞密度和叶绿素相对含量进行了测定，发现各种叶绿素荧光参数与Cd2+浓度呈显著的负相关，均随着Cd2+浓度的增加而降低。李涛等［37］在 6种 Fe3+浓度下培养雨生红球藻(Haeamatococcus pluvialis)，并对 F0、Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ、qP和qN进行了测定，发现在低浓度Fe3+(1.79 μmol/L)和高浓度 Fe3+(71.6 μmol/L)下 Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ和 qP均明显下降，而 F0和 qN 在两种浓度下都上升。陈雷等［38］在不同Cu2+浓度不同时间下培养斜生栅藻(Scendesmus obliquus)，并对Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ、rETR、叶绿素 a、叶绿素 b 及胡萝卜素含量等进行了测量，发现在高浓度Cu2+(20 ～100 μmol/L)下，Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ和 rETR 等参数随着胁迫时间延长，数值下降幅度显著，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量也明显下降。低浓度Cu2+(0～10 μmol/L)下，上述参数变化不显著。简建波等［39］研究不同浓度 Cu2+暴露对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的影响发现，Y、Fv/Fm对Cu2+非常敏感，它们均随Cu2+浓度的升高而显著下降。曹春晖等［40］运用叶绿素荧光技术研究Mn对米氏凯伦藻(Karenia mikinotoi MACC/D23)的影响发现，当Mn浓度为10-12～10-18mol/L时，Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ和rETR在第3～9天随着起始Mn浓度的增加而升高，Fv/Fm和Fv/F0在第2～7天随培养时间的延长而增加，qP在整个培养周期内随Mn浓度升高呈下降趋势，qN则呈先下降后上升趋势。王山衫等［41］在不同Zn2+浓度下培养固氮鱼腥藻(Anabaena azotica Ley)，并对叶绿素荧光参数Fv/Fm进行了测定发现，随着Zn2+浓度的升高，Fv/Fm降低，当 Zn2+浓度为 1.0 μmo/L时，Fv/Fm达到最高值。Ivorra 等［42］研 究 了 Zn2+对微小异极藻(Gomphonema parvulum)的影响，在富含 Zn2+(60000 μg/L)的培养液中处理5 h后，其F0和Y显著下降。Lu［43］研究发现，Hg2+对蓝藻有急性毒性作用，Fv/Fm、Fv'/Fm'、ΦPSⅡ、qP 和 qN 随 Hg2+浓度的升高而逐渐下降。

3 展望

微藻是水环境中的第一营养水平，对外界环境异常敏感，对抑制光合作用的环境因子都能够做出快速、准确的反应。而这些变化又可以通过先进的叶绿素荧光技术，用荧光参数准确反映出来。利用该特点可以进一步运用于:1)建立一种以微藻光合作用，叶绿素荧光技术为基础的环境监测标准，环境预警机制;2)进一步拓展其研究领域，探讨叶绿素荧光技术在浮游植物对环境污染反应的监测、水体中营养盐限制情况的检测、赤潮(或水华)的检测以及赤潮(或水华)的发生机理等研究中的应用。但是，纵观上述对微藻叶绿素荧光参数的研究进展，既往的研究主要在环境因子对微藻叶绿素荧光影响的理论层面，对微藻叶绿素荧光参数变化的深层次含义研究挖掘不够，尤其是对于研究叶绿素荧光参数与环境因子之间的特异性响应方面还有待进一步挖掘。同时研究大多局限于在单一的环境因子影响下进行、没有表现自然环境的特性，因此要进一步模拟现实环境，扩展研究中环境因子的范围(如生物、冷却水、辐射等)，并进行多种环境因子的叠加、交替试验。随着叶绿素荧光理论研究和测定技术的进一步发展，叶绿素荧光分析技术必将会在微藻的研究中起着越来越重要的作用，为建立基于微藻叶绿素荧光技术的环境监测方法和标准提供条件。

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