针刺对神经干细胞海马内移植老年性痴呆大鼠行为学和NPY 表达的影响＊

杨春壮 马 英 刘艳翠 徐永良 郑海兴 陆迪 任宝松 李俊俊 牡丹江医学院（牡丹江157011）

老年性痴呆（Alzheimer Disease，AD）多发生在老年，以近期记忆障碍为主要临床症状，其病因及发病机理尚不清楚，多种治疗方法目前正在探索中。NSCs具有自我更新能力，并有向多细胞（神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等）分化的潜能［1］。目前NSCs对AD 的治疗具有潜在的治疗前景［2－3］。而针刺对NSCs移植后的影响文献报道较少。本实验采用β－AP向海马CA1区定向注射制做AD 模型，利用体外分离培养的NSCs移植入AD 大鼠，探讨针刺对NSCs移植后对AD 大鼠海马NPY 表达的影响，改善AD 鼠的学习记忆能力。

1 材料和方法 1.1 仪器和试剂 KWD－808Ⅱ型电针仪（上海），脑立体定位仪，NPY 免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。DMEM／F12（1∶1）培养基和B27无血清添加剂、表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、β—AP（美国Sigma公司）。

1.2 AD 动物模型的制备 健康成年雄性Wistar大鼠60只，体重（300±50）g［由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK（黑）2008004］，随机分为5组，正常对照组（正常组）12 只，其余单侧（左侧）海马注射β－AP 制作AD 模型。制做痴呆模型后，将剩余48只随机分成4组：模型组12只，针刺组12只，NSCs移植组（移植组）12只，移植后针刺组（移植针刺组）12只。大鼠用20%乌拉坦（0.55mL／kg）行腹腔注射，动物麻醉后采用平头颅位固定于脑立体定位仪上，按脑立体定位图谱（AP＝2.22mm ML＝3.0mm DR＝2.8mm）向海马注射1μLβ—AP（恒温培养箱37℃卵育1W，临用前生理盐水配制成5μg／μL浓度）。缓慢匀速推注，时间不少于5min，再留针3min。正常组不注射。

1.3 NSCs的分离和纯化 取新生24h以内的Wistar大鼠在无菌条件下分离海马，经胰蛋白酶消化、吹打制成单细胞悬液，以（4～6）×104／mL的细胞浓度加入含B27、表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（终浓度均为10 ng／mL）的DMEM／F12无血清培养基的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养。每天镜下观察，待原代克隆形成后机械分离成单细胞悬液，按上述条件继续培养。以后每5～7d分离克隆传代一次，方法同前。

1.4 海马内NSCs移植 将传至第4代的NSCs球悬液移入10mL的离心管内，吹打制成单细胞悬液，调整细胞浓度至1×104／μL 备用。动物模型建立后，行同侧（左侧）海马NSCs移植。坐标为：AP＝2.22mm ML＝3.0mm DR＝2.8mm，用10μL的微量注射器吸取5μL 细胞悬液，将注射器固定于脑立体定位仪上，在20min内注射完毕，留针5 min。缓慢拔出针头，缝合皮肤。

1.5 针刺方法 采用30号1寸毫针，选取大鼠百会、大椎、人中三个穴位，直刺0.5寸，接通KWD—808Ⅱ型电针仪，刺激参数：疏密波，频率10Hz，电压1.5V，留针10min，持续电刺激，每日1次，连续30d。

1.6 跳台实验 针刺后，隔日进行跳台实验。实验时，将大鼠放入装置中，使其适应3min，然后通以40V 交流电。大鼠受电击后，其正常反应是跳到安全台躲避电击。记录通电后大鼠受电击至跳上跳台的时间，作为反应期。

1.7 组织切片 跳台实验测试完毕后隔日麻醉动物，经左心室－升主动脉罐注200mL生理盐水和250mL 含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）。取脑后固定2～4h，依次入含15%蔗糖和30%蔗糖PB液中置4℃冰箱过夜，沉底备用。用冰冻切片机将海马作冠状连续切片，片厚5μm。

1.8 免疫组化步骤 ①脱蜡、水化组织切片。②3% H2O2去离子水孵育5～10min，阻断内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3次。③热修复抗原：将切片浸入0.01M 枸椽酸盐缓冲液（1000mL）蒸馏水中（C6H5Na3O7·2H2O 3g，C6H8O7·H2O 0.4g，PH 为6.0），微波炉加热至沸腾后断电，间隔10 min后，反复2 次。冷却后0.1M PBS（100mL 蒸馏水中加NaCl 9g，NaHPO4·12H2O 6g，Na2HPO4·2H2O 0.4g，PH7.2～7.4）洗涤2次。④滴加一抗（兔抗大鼠NPY），工作浓度1：50，放入湿盒4℃过夜。⑤滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃30min。0.1MPBS洗2min×3次。⑥DAB显色：使用DAB显色试剂盒（ED1022）。取1mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C 试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～10min之间。蒸馏水洗涤。⑦苏木素轻度复染脱水、透明、封片。显微镜观察并拍照。

2 结 果 2.1 针刺后各组大鼠学习成绩

表1 针刺后各组大鼠学习成绩的比较（±s单位：s）

表1 针刺后各组大鼠学习成绩的比较（±s单位：s）

与模型组比较△P＜0.05 与正常组比较▲P＜0.01

组 别n 反应期正常组12 5.25±4.71模型组12 10.68±8.96▲移植组12 6.76±10.65△针刺组12 5.91±6.21△移植针刺组12 5.76±7.52△

2.2 针刺对各组大鼠海马NPY 表达的影响

表2 针刺对各组大鼠海马NPY 表达影响的比较（±s mm2）

表2 针刺对各组大鼠海马NPY 表达影响的比较（±s mm2）

与模型组比较△P＜0.01 与正常组比较▲P＜0.05与移植组比较◇P＜0.05

组 别n NPY 阳性细胞面密度正常组12 0.1084±0.0157模型组12 0.0711±0.0251▲移植组12 0.1263±0.0193△针刺组12 0.1128±0.0317△移植针刺组12 0.1580±0.0294△◇

3 讨 论 老年性痴呆（AD）是由多种原因引起的脑退行性疾病，临床常伴随有学习记忆能力的下降，病理检查发现海马、皮层、杏仁核中NPY 免疫反应阳性神经元显著减少，同时还伴有［3H］NPY 结合水平显著下降［4］。现已知，NPY 是哺乳动物神经系统中含量最丰富的多肽之一，对动物的学习记忆过程有着明显的调节作用［5］。NPY 在中枢神经系统中主要分布在大脑皮层、海马结构、丘脑、下丘脑及脑干等处，尤以海马结构中浓度最高，而海马结构是调节学习和记忆的关键部位［6］。在海马结构中，大量的NPY 神经元存在于CA1区的锥体细胞层、CA2与CA3区的多形层以及齿状回的门区。已有多项研究结果发现，在伴有学习记忆损害的疾病中可见到中枢神经系统NPY 免疫阳性神经元数量的明显减少［7］。NSCs治疗AD 的目的主要通过两种途径：①内源性途径，即诱导内源性NSCs增殖与分化，使受损伤的中枢神经系统进行自我修复；②外源性途径，即直接替代缺损组织或植入基因工程细胞，这一类细胞能分泌促进干细胞增殖与存活的因子［8］。NSCS移植治疗改善大鼠的空间学习记忆能力的机制目前还不完全清楚，可能的机制有：①移植的NSCs使基底前脑胆碱能神经元数目明显增加，代替溃变的胆碱能神经元，同时提高了中枢胆碱能系统的活性，改善隔区、海马等记忆中枢的功能。②移植的NSCs通过与宿主细胞的相互作用使脑内核酸和蛋白质的合成增加，提高了大脑的兴奋状态。③移植的细胞在体内分泌一些细胞因子和神经营养物质，从而促进神经元的存活和神经纤维的再生，形成侧支发芽，提高胆碱能纤维的数量。④证据表明，无论是在发育、成熟还是在衰老过程中，突触都处于不断的退化和重建的动态过程之中，NSCs通过诱导宿主脑突触的可塑性使退变的组织细胞产生新的突触。

现代研究认为，针刺主要通过以下四个方面达到延缓衰老目的：一是提高机体免疫功能；二是可改善脑的氧代谢和血流量；三是可调整神经生化代谢的紊乱；四是可减少自由基的产生。中医文献中无“老年性痴呆”的病名，根据其临床表现认为本病属中医“呆病”、“健忘”、“癫证”等范畴。其病因病机为肝肾亏虚、气滞血瘀，以肾气虚衰、髓海空虚、脑神失养为其根本。临床研究表明针灸治疗AD 疗效显著。针刺治疗AD 的原则是补肾活血、醒神开窍。补肾活血以治其本，醒神开窍以治其标。标本同治，尽早缓解症状，提高患者生存质量。

在上述治疗原则的指导下，本实验选取百会、大椎、人中三穴。百会穴为督脉和足太阳膀胱经的交会穴，具醒神开窍之功，为治疗老年性痴呆的主要穴位，经临床证实对于本病可能出现的精神、神志异常均有一定的疗效。大椎出自《素问·气府》，属督脉经穴位，是手足六阳经的交会穴，为“诸阳之会”，可通调诸经，增强各脏腑经络之功效，促使阴阳平衡。人中位于鼻下嘴上，鼻通天气，嘴通地气，该穴位于天地之间，正是“诸阳之海”的督脉与“诸阴之海”的任脉交会点，具有调合阴阳之功，能涤荡蒙蔽、醒脑开窍、疏经通络的作用。取此三穴，可通督调神、调合阴阳，有畅行血脉、行气化痰、活血生精、藏精生髓之功。AD 最早最重要的症状之一即近期记忆障碍，基于此，本实验采用大鼠跳台实验，以验证其学习记忆功能。跳台实验是一次性回避反应实验，操作简单，能够比较客观地反映动物经过一次刺激后记忆的获得能力。实验表明针刺能够减少AD 大鼠的跳台反应期，改善学习记忆。结合AD 病变中海马NPY免疫反应阳性神经元显著减少，本实验以免疫组化方法定量测定了NPY 的表达。结果显示，移植针刺组大鼠海马NPY 表达比模型组增加（P＜0.01），同时与移植组比较有显著性差异，说明针刺结合干细胞移植比单纯干细胞移植效果更好。

［1］ Fibiger HC.Cholinergic mechanisms in learning，memory and dementia：a review of recent evidence［J］.Trends Neurosci，1991，14（6）：220－223.

［2］ Chow S Y，Moul J，Liu Y，et al.Survival and differentiation of rat spinalcord stem cells grafted into normal and in－jured adult spinal cord［J］.SocNeurosci Abstr，1998，23（2）：905－918.

［3］ Asahara T，Kalka C，Isner JM.Stem cell therapy and gene transfer forregeneration［J］.Gene Ther，2000，7：451－457.

［4］ Redrobe，JP，Dumont Y St－Pierre JA，et al.Multiple receptors for neuropeptide Y in the hippocampus：putative roles in seizures and cognition［J］.Brain Res，1999，848（1－2）：153－66.

［5］ 池 霞.神经肽Y 与学习记忆的研究进展［J］.国外医学：儿科学分册，2002，29（2）：67－70.

［6］ 林 鸿，季 迁，李敏，等.海马损伤对大鼠学习和记忆的影响［J］.中国临床康复，2002，6（13）：1912.

［7］ Bracci－Laudiero L，Aloe L， Lundeberg T， et al.Altered levels of neuropeptides characterize the brain of lipus prone mice.Neurosci Lett 1999，275：57－60.

［8］ 武 强，李露斯.神经干细胞治疗阿尔茨海默病研究进展［J］.中国康复理论与实践，2006，12（10）：871－874.