大鼠脑挫伤后细胞间黏附因子1时序性表达的实验性研究

顾均连 焦 炎 梁新华

山西医科大学法医学院病理教研室，山西太原 030001

细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）是一种糖蛋白，属免疫球蛋白超家族，脑组织中几乎所有的细胞均有ICAM-1的表达，其中微血管细胞是ICAM-1的靶细胞，颅脑损伤时，会引起一系列的炎症反应，该蛋白常存在于炎症部位的多种细胞表面，研究发现[1-2]，正常脑血管内皮细胞中ICAM-1的表达极低，当发生脑缺血缺氧或者弥漫性脑损伤后其表达上调，但目前在国内外对大鼠脑挫伤中ICAM-1的表达规律研究很少。本实验欲通建立大鼠闭合性脑挫伤模型，对大鼠脑挫伤后脑组织中ICAM-1的变化规律进行观察，研究其与脑挫伤早期损伤时间的关系，可以为法医学中早期损伤时间的推断提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

健康成年Wistar大鼠56只（山西医科大学实验动物中心提供），体重250～300 g，雌雄不限，随机分成阴性对照组和脑挫伤后1 h、6 h、24 h、48 h、72 h、7 d组，共7组，每组8只。

1.2 材料及来源

兔抗大鼠ICAM-1抗体购自北京博鳌森生物技术有限公司，生物素标记羊抗兔抗体购自北京康为世纪生物技术有限公司，组织蛋白抽提试剂盒、蛋白定量试剂盒、发光剂均购自普利莱因技术有限公司。

1.3 模型制备和取材

参照Feeney法[3]建立大鼠闭合性脑挫伤，大鼠称重后，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉，常规消毒铺巾，褪毛，正中线切开头部皮肤，分离骨膜，在人字缝前方3 mm，颅骨中线左侧3 mm处，钻直径5 mm的圆形骨窗，保持硬脑膜完整，用自制的硬性打击垫放入骨窗，以50 g砝码在40 cm处落下打击一次；对照组仅切开头皮，钻孔等，不受自由落体物打击，然后直接处死取出脑组织，实验组大鼠分别在伤后1 h、6 h、24 h、48 h、72 h、7 d处死，于挫伤部位取出脑组织，然后分别称取100 g脑组织，放在液氮里密封存。

1.4 方法

本实验采用Western blot方法对大鼠脑挫伤后不同时间段ICAM-1的表达进行检测，从液氮中取出称重好的组织，加入蛋白裂解液，匀浆机中充分快速匀浆，在4℃提取蛋白后备用，加1︰2的样品缓冲液混匀，沸水浴5 min，取出样品混合液，对照组用加样缓冲液代替蛋白质样品，加在8%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离蛋白质，然后用半干式电转移法将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用封闭液浸泡，4℃过夜，取出滴加一抗，4℃过夜，用TBST溶液冲洗5 min×4次，滴加生物素标记的羊抗兔抗体，室温孵育2.5 h，TBST溶液充分淋洗5 min×4次，PBS淋洗10 min×4次，然后发光显影，固定[4-7]。

1.5 图像分析及统计学方法

用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对图像进行分析，以条带积分光密度值（integrate optical density，IOD）作为ICAM-1的相对量。用SPSS 13.0软件对所得的数据进行组内和组间的方差分析，统计方法为方差分析，计量资料采用均数±标准差表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫印迹结果图像分析结果

大鼠脑挫伤后1 h可见条带明显增宽，到72 h条带增至最宽，到7 d还可见条带比阴性对照组略宽（图1），经内参β-actin的校正，使用Image-Pro Plus 6.0分析软件对ICAM-1免疫印迹条带进行分析，以条带IOD作为ICAM-1的相对量，可见大鼠脑挫伤后1 h就有少量的ICAM-1表达，24 h后逐渐增多，到72 h达到最高峰，其后下降，伤后7 d仍有表达，且高于对照组水平。见表1。

图1 大鼠脑挫伤后不同时间段ICAM-1免疫印迹条带

表1 大鼠脑挫伤后不同时间段ICAM-1的IOD值（±s）

表1 大鼠脑挫伤后不同时间段ICAM-1的IOD值（±s）

组别 只数 IOD值对照组1 h组6 h组24 h组48 h组72 h组7 d组8888888 20861.40±632.103▲53534.22±179.892▲72511.80±660.590▲91988.40±682.893▲131555.2±508.860▲176958.11±1274.026▲41611.38±587.171▲

2.2 数据处理

统计学结果显示：各实验组与对照组分别对比，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而各实验组之间两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

3 讨论

脑挫伤是指头部外力作用引起的脑组织出血性坏死，这是脑损伤中最常见的一种损伤，也是颅脑损伤中导致死亡的原因之一，研究表明[8]，组织损伤后会引起一系列的炎性反应。黏附因子是在炎性反应过程中起重要的作用的因子，它是由细胞产生、存在于细胞表面、介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子，主要由3组黏附因子组成，分别是选择素家族，免疫球蛋白家族，钙粘蛋白家族，其中起核心作用的是ICAM-1，ICAM-1是免疫球蛋白家族的重要成员，介导多种炎性因子与血管内皮细胞的黏附。许多研究表明[9]，颅脑损伤后ICAM-1的表达增多，白细胞与血管内皮细胞间黏附力增强，白细胞通过内皮细胞间隙可进入周围脑组织，释放大量炎性介质和细胞因子，其中许多细胞因子可直接或间接调节ICAM-1在炎症反应中的表达，使其表达增多，其中包括核转录因子（NF-κB）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、白介素1β（IL-1β）等多种细胞因子。

本实验运用Western blot方法对ICAM-1蛋白表达进行观测，实验结果显示，大鼠脑挫伤后脑组织中ICAM-1蛋白表达在损伤1 h后开始有微量的增多，24 h明显增多，在72 h到达顶峰，其后下降，7 d后仍有表达，且高于对照组水平，可见其表达有一定的规律性，分析原因可能为：脑组织挫伤后，ICAM-1在脑血管内皮细胞上的表达开始增多，使得白细胞与血管内皮细胞的黏附力不断增强，随着时间的延长，白细胞跨过内皮细胞间隙进入周围组织，释放多种炎性因子，内皮细胞可在多种细胞因子如NF-κB、TNF等刺激下诱导ICAM-1的表达增多，在72 h达到高峰，随着损伤时间的延长，组织细胞自我修复，炎性反应消退，细胞因子逐渐减少，使得ICAM-1的表达逐渐下降。ICAM-1在脑挫伤过程中随着时间的延长产生规律性的变化，可以为法医学中脑挫伤早期损伤时间推断提供一定的依据。

[1]Feuerstein GZ，Wang X，Barone，FC.The role of cytokines in the neuropathology of stroke and neurotrama[J].Neuroimmunomodulation，1998，（3-4）：143-159.

[2]Grady MS，Cody RF Jr，Maris DO，et al.P-selectin blockade following fluid-percussion injury：behavioral and immunochemical sequelae[J]J Neurotrauma，1999，16（1）：13-25.

[3]张荣军，游潮，蔡博文，等.Feeney法建立大鼠闭合性脑损伤模型及评估[J].中国修复重建外科杂志，2005，19（12）：1015-1018.

[4]李雷波，李梅，廖志钢，等.大鼠皮肤挫裂创细胞间粘附因子-1的表达al activation[J].中国法医学杂志，2003，18（3）：77-80.

[5]周官恩，刘宗超，饶明俐，等.实验性脑出血后ICAM-1和IL-1的表达与p38MAPK通路关系研究[J].中风与神经疾病杂志，2011，28（1）：18-20.

[6]ShenA，Yang J，GuY，et al.Lipopolysaccharide-evoked activation ofp38 and JNK leads to an increase in ICAM-1 expression in Schwann cells of sciatic nerves[J].FEBS J，2008，275（17）：4343-4353.

[7]Wang CX，Shuaib A.Involvement of inflammatory cytokines in central nervous system injury[J].ProgNeurobio，l 2002，67（2）：161-172.

[8]王翀，朱贤立，赵洪洋，等.ICAM-1在大鼠弥漫性脑损伤后的脑组织水肿中得表达及其意义[J].中国临床神经外科杂志，2006，11（4）：219-221.

[9]张卫民，雷鹏.细胞间黏附分子-1在颅脑损伤中的表达和炎症介导作用[J].创伤外科杂志，2008，10（1）：82-84.