生长激素释放肽在非小细胞肺癌组织的表达及其意义

张晓飞 魏亚强

1.陕西省延安市人民医院肿瘤科，陕西延安 716000；2.陕西省延安市人民医院呼吸内科，陕西延安 716000

1999年，Kojima等[1]发现生长激素释放肽（Ghrelin）是促生长激素分泌物受体（GHS-R）的第一个内源性配体，由28个氨基酸残基构成的一种小分子多肽。Ghrelin主要的产生部位是胃黏膜，但是在多种组织中也有表达，如肠道、胰腺、下丘脑、垂体、肾、胎盘等[2-4]，Ghrelin作为一种脑肠肽表现出了不同的生理调节功能。本次研究选择2007年9月～2009年12月我院收治的非小细胞肺癌（NSCLC）患者标本72例，所有患者均施行根治性手术治疗，通过观察Ghrelin在NSCLC组织中的表达，探讨其临床意义，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为2007年9月～2009年12月在我院施行根治性手术治疗的NSCLC患者72例，设置肺正常组织作为对照，选择同期手术正常标本30例，经过病理HE染色确诊全部病例符合研究标准。72例患者中，男41例，女31例；年龄36～75岁，平均（64.5±2.5）岁；所有患者均未在术前接受任何的化疗放疗。患者在鳞癌、腺癌、高分化癌、中分化癌和低分化癌分别有42、30、28、22、22例。TNM分期（2009年肺癌国际分期修订版）中，Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期27例，发生与未发生淋巴结转移的各为32例和40例。

1.2 方法

1.2.1 试剂 纯化兔抗人Ghrelin抗体（一抗）（北京博奥森生物技术有限公司生产）。二抗和三抗的S-P试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司生产），包括内源性过氧化物酶阻断剂（3%双氧水），正常山羊血清工作液，二抗（生物素标记的山羊抗兔IgG）工作液，三抗（辣根酶标记的链霉卵白素）工作液，DAB（3，3-二氨基联苯胺）试剂盒。

1.2.2 标本处理及组织切片 所有组织标本都采用10%中性甲醛溶液进行固定，常规进行脱水，石蜡包埋处理，切片厚度5μm，胶片捞片均涂有氨丙基-三乙氧基硅烷。

1.2.3 免疫组织化学法检测 免疫组化SP法，在60℃烤箱中放置染色石蜡切片，烤40 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。用pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，然后滴加3%双氧水封闭，室温下进行10 min，以去除内源性过氧化物酶。用PBS冲洗5 min，冲洗3次；然后山羊血清封闭，室温下进行15 min；然后，滴加50μL一抗溶液，在4℃温度下过夜。第2天，采用PBS冲洗5 min，冲洗3次，然后滴加二抗溶液，在37℃的温度孵育30 min；然后用PBS冲洗5 min，冲洗3次，然后滴加三抗溶液，在37℃的温度下孵育30 min；3，3-二氨基联苯胺显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。光镜观察，空白阴性对照组每次染色的时候都以0.01 mmol/L PBS代替一抗溶液。

1.3 结果判断标准

应用双人双盲法进行全面的观察与判断，主要判断标准有：①阳性细胞：肿瘤细胞的胞浆内有棕黄色颗粒并且染色强度显著高于非特异性背景着染。②显微镜下每例随机选择10个高倍视野（×400），然后计算出阳性细胞的百分比。根据阳性细胞的百分比分为2级：阴性：无阳性细胞或≤10%，阳性：＞10%。

1.4 统计学方法

本次研究所得数据均采用SPSS 17.0统计软件给予处理，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ghrelin在肺正常组织与肺癌组织中的表达

肺正常组织与肺癌组织的Ghrelin的表达中，阳性率分别为13.33%和58.33%，前者明显低于后者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。Ghrelin阳性信号位于肺癌细胞浆内，呈棕黄色颗粒。肺癌组织中Ghrelin的表达见图1。

表1 肺癌组织与肺正常组织中Ghrelin的表达（例）

图1 不同肺癌组织中Ghrelin的表达情况（免疫组化SP法）

2.2 Ghrelin在肺癌组织的表达及临床意义

Ghrelin在肺癌组织中表达与临床病理参数之间不存在统计学差异的包括性别、吸烟与否、分化程度、病理分型，即P＞0.05；Ghrelin在肺癌组织中表达与临床病理参数之间存在统计学差异的为临床分期和淋巴结转移与否，即P＜0.05。见表2。

表2 肺癌组织中Ghrelin的表达与临床病理参数的关系（例）

3 讨论

Ghrelin是迄今发现的唯一一种GHS-R的内源性配体，Kojima等[1]于1999年就已经开展研究并通过采用免疫组化的方法从小鼠和人的胃内分泌细胞及下丘脑弓状核中将Ghrelin分离出来，名称的来源是因为具有促进生长激素释放的作用。Ghrelin是一种由28个氨基酸组成的3位丝氨酸酰基化的小分子多肽，Ghrelin主要的产生部位是胃黏膜，但是在多种组织中也有表达，比如肠道、胰腺、下丘脑、垂体、肾、胎盘等[2-4]；Ghrelin的受体在很多组织中都有分布具不同亚型，比如脑、心脏、肺、胰腺、肠、脂肪组织及肾脏等[5]，Ghrelin具有广泛的生物学效应与其具有广泛的受体分布有紧密联系。研究表明，Ghrelin异常高表达具有促使细胞过度增殖及其恶性转化的作用，另外研究还证明，Ghrelin与部分肿瘤在病发和恶化发展过程中有着紧密的关系，但是在肺癌中Ghrelin与其相互之间的作用关系当前还无法明确。

Ghrelin在肿瘤的发生过程中可能具有一定的意义，因为大量的研究研究表明，Ghrelin在中枢神经系统的垂体瘤[6]、乳腺癌组织和细胞株[7]、胃神经内分泌细胞增生和肠癌[6]、甲状腺滤泡状癌、甲状腺癌细胞株[8]等多种上皮细胞起源的肿瘤组织及其癌细胞株中存在表现情况，也有相关报道显示，Ghrelin在部分的固醇类组织也能表达，包括睾丸、前列腺等[9]。发现Ghrelin和GHS-Rla的mRNA和蛋白两者同时都在前列腺癌细胞株（ALVA41、DU145、LNCaP和PC-3）中表达[10]。研究表明Ghrelin起到了一种促癌基因的作用，能够促进肿瘤的发生及其发展。但是另外的一些研究却认为，Ghrelin可能起到了一种抑癌基因的作用，抑制了乳腺癌、肺癌、甲状腺癌细胞株的增殖，因为在临床中不同类型的组织、细胞以及采用差异化的实验方法都能引致两者的结果出现不一致的情况。

据研究报道[11]显示，Ghrelin GHS-1a mRNA的表达情况在不同的分泌性，包括内分泌和非内分泌性的肺癌组织中均可能实现。Karapanagiotou等[12]临床实践中通过对101例不能接受相关手术的NSCLC患者进行检测，并选择正常健康人的血清60例作为对照，检测Ghrelin的结果表明，Ghrelin水平在肺癌病患中明显高于健康者（P＜0.05），提示肺癌的形成可能与患者的Ghrelin水平增高具有相关性。本次研究结果表明，Ghrelin表达在阳性率上肺癌组织的表达情况明显要比肺正常组织者要高，差异有统计学意义（P＜0.05），结果显示，Ghrelin表达增高、活性增强从而使得急速了细胞周期、促进细胞在增殖上的速率，参与到肺癌的形成病发及发展等过程中；此外，有学者研究认为肺癌发病的主要因素之一就是因为出现细胞凋亡障碍问题，而该问题的产生与Ghrelin被激活、与细胞凋亡有关的抑癌基因p73等下游基因发生突变有直接的关系。本次研究结果还表明，生长激素释放肽在肺癌组织中表达与临床病理参数之间不存在统计学差异的包括性别、吸烟与否、分化程度、病理分型，即P＞0.05，生长激素释放肽在肺癌组织中表达与临床病理参数之间存在统计学差异的为临床分期和淋巴结转移与否，即P＜0.05。临床分期越晚，表达越高；肺癌组织中，出现淋巴结转移的Ghrelin表达明显比无转移的高，提示肺癌组织中的淋巴转移与Ghrelin有相关性。

综上所述，Ghrelin表达与肺癌的形成与发展存在密切的关系，对于肺癌早期诊断有积极的意义，并作为一个重要的指标应用于肺癌的诊断中，在研究结果中显示，患者受到肺癌的侵袭后，发生转移的过程与Ghrelin的表达也存在明显的关系，表明肿瘤具有比较高的浸润性及其不良预后。

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