神经生长因子通过TrkANGFR信号途径促进肝细胞增殖*

李俊峰， 舒建昌， 陈莲香， 朱海燕， 吕 霞

(1 暨南大学附属第一医院消化科，广东 广州510630;2 暨南大学附属第四医院 消化科，广东 广州510175)

肝纤维化是肝损伤-修复和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积的病理过程。肝细胞损伤和肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化是这一过程的中心环节［1］。改善肝细胞损伤、抑制肝细胞凋亡，诱导活化的HSCs 凋亡，可逆转肝纤维化［2-4］。神 经 生 长 因 子(nerve growth factor，NGF)/p75NTR神经内分泌信号肽途径调控肝星状细胞分化、增殖和凋亡，参与肝损伤-修复过程［5-7］。但是NGF 对肝细胞作用研究较少，本研究旨在探讨外源性重组人NGF-β 对肝细胞的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞株 人正常肝细胞株L02 购自中科院上海细胞生物研究所。

1.2 试剂及抗体 DMEM 培养基、0.25%含EDTA胰蛋白酶(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、重组人NGF -β(R＆D)，兔抗神经生长因子抗体(rabbit anti-nerve growth factor，anti-NGF)、兔抗神经营养素受体p75抗体(rabbit anti - neurotrophin receptor p75，anti -p75NTR)、兔抗神经生长因子受体TrkA 抗体(rabbit anti-tyrosine kinases receptor A，anti-TrkANGFR)(武汉博士德公司)，3，3'-［1 -(苯氨酰基)-3，4 -四氮唑］-二(4 -甲氧基-6 -硝基)苯磺酸钠{2，3 -bis(2 -methoxy - 4 -nitro - 5 -sulfophenyl)-5 -［(phenylamino)carbonyl］-2H -tetrazolium hydroxide，XTT}(BBI)，吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)(Sigma)，Annexin V - FITC/propidium iodide(PI)凋亡试剂盒(南京凯基公司)，即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒、DAB 显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，Trizol、Taq DNA polymerase(Invitrogen)，SYBR PrimeScript PCR 试剂盒(TaKaRa)。

2 方法

2.1 细胞培养 L02 细胞株接种在加有1 ×105U/L青霉素、100 mg/L 链霉素、10%胎牛血清DMEM培养液中，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。根据倒置显微镜下细胞生长情况进行换液，注意监测培养基的pH 值，在细胞生长融合度达到80% ～90%时，0.25%含EDTA 胰蛋白酶消化传代，选对数生长期细胞进行实验。

2.2 免疫细胞化学染色法检测L02 细胞NGF、TrkANGFR和p75NTR蛋白的表达 每孔接种细胞1 ×105于6 孔板内的盖玻片上，孵育24 h 后，弃培养液，分别加入浓度为100 μg/L NGF-β 的培养液1 mL，同时设立不加试剂为对照组，继续培养24 h，PBS 冲洗3 次，每次3 min。加入2 mL 冷丙酮固定10 min，PBS冲洗细胞爬片3 min，重复3 次。3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10 min，PBS 冲洗3 min，重复3 次，每张爬片滴加正常非免疫动物血清封闭非特异性抗原，湿盒内室温孵育10 min，滴加兔抗人多克隆抗体(anti - NGF、anti - TrkANGFR和anti -p75NTR)，4 ℃孵育过夜。PBS 冲洗3 次，每次3 min，滴加即用型MaxVisionTM试剂，室温下孵育10 ～15 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min。DAB 显色试剂显色，自来水冲洗终止显色，苏木素复染1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜观察并拍片，以胞膜或胞浆棕色颗粒表达为阳性。

随机选取细胞爬片中的不同部位5 个高倍镜视野(×200)，显微镜下通过AxioVision 图像采集系统在同等条件下采集图片。利用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0 计算每个视野阳性表达细胞的平均吸光度值(average absorbance，AA)。每个视野阳性表达细胞的AA 等于视野阳性表达的积分吸光度值(integral absorbance，IA)/视野内细胞数。

2.3 荧光定量PCR 检测NGF、TrkANGFR和p75NTRmRNA 表达 每瓶接种细胞1 ×106于25 cm2培养瓶中，培养24 h 后，弃上清，分别加入含NGF - β(100 μg/L)的培养液4 mL，以不加试剂组为对照，继续培养24 h 后，收集所有细胞。Trizol 试剂提取细胞总RNA，采用Oligo (dT)引物和随机引物进行逆转录，以cDNA 为模板进行荧光定量PCR。NGF 上游引物5' - GACTCACAGGAGCAAGCGGT -3'，下游引物5'-CTGTGGCGGTGGTCTTATCC-3'，扩增片段长 度 107 bp; p75NTR上 游 引 物 5' -CTCGCGATTTCAAACCTGGA -3'，下游引物5'-TTGTGGGTGGCTTTACAGCTC-3'，扩增片段长度108 bp;TrkANGFR上 游 引 物 5' - ACCCTCTGTACCCCCGATCT - 3'，下游引物5' - TCGATGTAGCTTGCTGCCAA-3'，扩增片段长度102 bp;内参照β -actin 上游引物5'-GCGCGGCTACAGCTTCA -3'，下游引物5' - TCTCCTTAATGTCACGCACGAT -3’，扩增片段长度59 bp。PCR 反应条件:93 ℃3 min，93℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃45 s，循环40 次，重复3 次。

2.4 XTT 法检测NGF-β 对L02 细胞增殖的影响

调整细胞浓度，以每孔5×103接种于96 孔培养板中，每组设4 个复孔，孵育24 h 后，弃去上清，分别加入含不同浓度梯度(12.5、25、50、100、200、400、800、1 600 μg/L)的NGF-β 培养液100 μL，设不加NGF -β 对照，继续培养24 h，每孔加入50 μL XTT 比色液，避光孵育4 h，在主波长为490 nm、参考波长为630 nm 的连续光谱酶标仪上检测各孔吸光度(A 值)。

2.5 XTT 法检测anti-NGF、anti-TrkANGFR和antip75NTR对NGF-β 诱导的L02 细胞增殖的影响 接种细胞5 ×103于96 孔培养板中，每组设4 个复孔，孵育24 h，弃去上清，加入NGF(100 μg/L)孵育15 min 后，分别加入anti-NGF、anti-TrkANGFR和anti -p75NTR培养液(浓度为100 μg/L)，设不加药组为阴性对照，只加NGF - β 为阳性对照，继续培养24 h后，每孔加入50 μL XTT 比色液，避光孵育4 h，在主波长为490 nm、参考波长为630 nm 的连续光谱酶标仪上检测各孔吸光度(A 值)。

2.6 流式细胞仪(Annexin V - FITC/PI 法)检测NGF-β 对L02 细胞凋亡的影响 每孔接种1 ×106于6 孔板中，培养24 h，弃上清，分别加入不同浓度梯度(25、50、100、200、400 μg/L)的NGF - β 培养液，设不加NGF -β 组为对照，继续孵育24 h，收集所有细胞，1 000 r/min 离心弃上清，加入200 μL 结合缓冲液悬浮细胞，加入Annexin V-FITC 和PI 各2 μL，室温避光孵育15 min，流式细胞仪(BD FACSAria)检测L02 细胞凋亡情况，重复3 次。

2.7 流式细胞仪(PI 法)检测NGF -β 对L02 细胞周期的影响 每孔接种细胞1 ×106，于6 孔板中，培养24 h 后，分别加入不同浓度梯度(0、12.5、25、50、100、200 μg/L)的NGF -β，放置培养箱中继续孵育24 h 后，收集所有细胞，70%冷乙醇4 ℃固定，离心弃乙醇，加入200 μL PI 染液，混匀，过滤，流式细胞仪检测细胞周期，重复3 次。

3 统计学处理

结 果

1 L02 细胞NGF、TrkANGFR 和p75NTR 蛋白及mRNA 表达

L02 细胞表达NGF、TrkANGFR、p75NTR蛋白，外源性NGF-β 处理24 h 后的L02 细胞与未加药组比较，细胞胞浆、细胞核和细胞膜上出现较多的棕色颗粒，NGF 阳性表达的平均吸光度值(0.3880 ±0.0270 vs 0.2595 ±0.0241，P ＜0.05)和TrkANGFR蛋白阳性表达的平均吸光度值(0.3849 ±0.0194 vs 0.3110 ±0.0254，P ＜0.05)明显增大，与对照组比较差异有统计学意义;p75NTR蛋白阳性表达的平均吸光度值(0.2887 ±0.0759 vs 0.2524 ±0.0378，P ＞0.05)略有增大，与对照组比较差异无统计学意义，见图1。

Figure 1. NGF，TrkANGFR and p75NTR protein expression in L02 cells(immunocytochemistry，×200).A，C，E:control;B，D，F:TGFβ.A，B:NGF;C，D:TrkANGFR;E，F:p75NTR.图1 NGF－β 对L02 细胞NGF、TrkANGFR和p75NTR蛋白表达的影响

L02 细胞表达NGF、p75NTR和TrkANGFRmRNA，外源性NGF - β 上调了L02 细胞表达NGF mRNA(0.3550 ±0.2140 vs 0.2140 ±0.0135，P ＜0.01)和TrkANGFRmRNA (0.1586 ± 0.0289 vs 0.0644 ±0.0084，P ＜0.01)，与对照组比较差异有统计学意义;p75NTRmRNA (0.0130 ± 0.0034 vs 0.0063 ±0.0005，P ＞0.05)的表达差异无统计学意义，见表1。

表1 荧光定量RT－PCR 检测NGF、TrkANGFR 和p75NTR mRNA 的表达Table 1. NGF，TrkANGFR and p75NTR mRNA expression in L02 cells detected by fluorescent quantitative PCR (±s.n=3)

表1 荧光定量RT－PCR 检测NGF、TrkANGFR 和p75NTR mRNA 的表达Table 1. NGF，TrkANGFR and p75NTR mRNA expression in L02 cells detected by fluorescent quantitative PCR (±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control.

Group NGF TrkANGFR p75 NTR±0.0005 NGF 0.3550±0.0070＊＊0.1586±0.0289＊＊Control 0.2140±0.0135 0.0644±0.0084 0.0063 0.0130±0.0034

2 外源性NGF－β 对L02 细胞增殖的作用

外源性NGF -β 促进L02 细胞增殖，呈剂量依赖性，表现为倒立U 形曲线。25 ～200 μg/L 浓度范围内与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，25 μg/L 时增殖作用最强;400 ～1 600 μg/L 浓度范围内对L02 细胞增殖的作用与对照组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，见图2。

Figure 2. Effect of NGF-β on L02 cell proliferation at different concentrations (XTT assay). ±s. n =4. * P ＜0.05 vs control(0 μg/L).图2 XTT 比色法检测不同浓度NGF－β 对L02 细胞增殖的作用

3 Anti－NGF、anti－TrkANGFR 和anti－p75NTR 对NGF－β 诱导的L02 细胞增殖的作用

Anti-NGF 和anti-TrkANGFR抑制NGF -β 诱导的L02 细胞增殖，与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05);anti-p75NTR不影响NGF-β 诱导的L02细胞增殖，与阳性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见图3。

Figure 3. Effects of anti - NGF，anti - TrkANGFR and anti -p75NTR on NGF - β induced L02 cell proliferation(XTT assay). ±s. n =4. * P ＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs NGF-β.图3 Anti－NGF、anti－TrkANGFR和anti－p75NTR对NGFβ 诱导的L02 细胞增殖的影响

4 NGF－β 对L02 细胞凋亡的影响

外源性NGF -β 对L02 细胞有抗凋亡趋势，浓度50 μg/L 抗细胞凋亡的作用最强(1.2 ±0.2 vs 1.9±0.7)，但与对照组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，见图4。

5 NGF－β 对L02 细胞周期的影响

NGF-β 作用于L02 细胞周期的S 期，呈剂量依赖性，浓度为25 μg/L 作用最强(25.60% ±0.32%vs 21.10% ±0.30%)，与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.01)，200 μg/L 抑制L02 细胞分化(18.40% ±0.40% vs 21.10% ±0.30%)，与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.01)，见图5。

讨 论

NGF 是神经营养因子家族中重要的成员，是神经细胞及非神经细胞发育、增殖、分化和生存的重要因子。NGF 结合高亲和受体TrkANGFR激活细胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen - activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)级联引起细胞分化和存活。NGF 结合低亲和受体p75NTR，依赖募集到p75NTR细胞内结构域的因子不同，促进细胞生存、分化或凋亡［8］。肝细胞增殖时神经营养因子(neurotrophins，NTs)mRNA 和蛋白水平表达明显增高，NTs 可能对肝细胞增殖起重要作用［9-10］，Gigliozzi 等［11］研究发现外源性NGF 刺激胆管上皮细胞增殖。

Figure 4. The effect of NGF-β on apoptosis of L02 cells at different concentrations (flow cytometry assay). A:control (0 μg/L)B:25 μg/L;C:50 μg/L;D:100 μg/L;E:200 μg/L;F:400 μg/L. x¯±s.n=3.图4 流式细胞仪检测NGF－β 对L02 细胞凋亡的作用

本研究采用免疫细胞化学及荧光定量PCR 技术，发现增殖的肝细胞表达NGF 和TrkANGFR，弱表达p75NTR;外源性NGF -β 促进L02 细胞表达NGF 和TrkANGFR，与以前学者提出正常或损伤的肝细胞不表达TrkANGFR相矛盾，可能与细胞处在不同周期有关［10，12-13］。NGF 主要位于肝细胞的细胞质和细胞核，TrkANGFR和p75NTR主要位于细胞膜和细胞质。外源性NGF-β 对肝细胞的作用呈双峰模式，调控细胞周期的S 期，低剂量(25 ～200 μg/L)促进L02 细胞增殖，抗肝细胞凋亡，呈剂量依赖性，与不加NGF-β 组比较差异有统计学意义，25 μg/L 增殖作用最强，高剂量(400 ～1 600 μg/L)抑制L02 细胞增殖;增殖曲线呈倒立的U 字形，与Kemp 等［14］研究认为低剂量NGF 促进感觉神经元轴突生长，高剂量抑制轴突生长一致，可能机制是NGF 的生物学效应与膜受体相对比值有关，NGF 低浓度时先结合TrkANGFR受体，高浓度时TrkANGFR受体饱和，增加了NGF与p75NTR结合，从而抑制细胞增殖。中和抗体anti -NGF 抑制外源性NGF -β 诱导的L02 细胞增殖，可能原因是anti-NGF 中和了L02 细胞自身分泌的和外源性NGF;中和抗体anti - TrkANGFR阻碍NGF 与TrkANGFR结合，从而抑制细胞内信号通路，抑制肝细胞的增殖;中和抗体anti -p75NTR与p75NTR细胞外域结合，阻止NGF 与p75NTR结合，抑制NGF/p75NTR信号途径，细胞凋亡减少;因此NGF 可能通过NGF/TrkANGFR信号通路，调控L02 细胞的增殖和分化。外源性NGF-β 能够上调L02 细胞表达内源性NGF，可能是启动了内分泌的级联反应，与促进L02 细胞增殖有关，增殖的L02 细胞分泌更多的NGF，确切机制需进一步研究。

Figure 5. Effect of NGF-β on cell cycle of L-02 cells (flow cytometry assay). A:control (0 μg/L);B:12.5 μg/L;C:25 μg/L;D:50 μg/L;E:100 μg/L;F:200 μg/L. x¯±s.n=3. * P ＜0.05 vs control.图5 NGF－β 对L02 细胞细胞周期的影响

本研究发现增殖的L02 细胞分泌NGF，表达受体TrkANGFR和p75NTR;外源性NGF -β 上调NGF 和TrkANGFR蛋白的表达，促进肝细胞分化、增殖，为预防和治疗肝纤维化提供新的靶点。

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