干扰素诱导蛋白p204表达变化对大鼠血管平滑肌细胞增殖及p21表达的影响*

龙向淑， 吴 强， 宋 方

(贵州省人民医院心血管内科，贵州贵阳550002)

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是维持血管张力和功能的主要细胞成分，在动脉粥样硬化、高血压以及冠状动脉介入治疗术后再狭窄等血管增殖性疾病的发生、发展过程中扮演着非常重要的角色。干扰素诱导蛋白p204(interferon－inducible protein 204，p204)是干扰素(interferon，IFN)诱导蛋白p200家族的鼠类蛋白成员，其编码基因Ifi204由耶鲁大学Lengyel教授等首先发现并成功克隆［1］，在鼠的心肌、骨骼肌、肾及成骨细胞等多种组织、细胞存在丰富表达［2］。有研究［3－5］显示，p204可通过多种机制抑制多种细胞型的增殖，但p204在VSMCs是否存在基础表达及其对大鼠VSMCs增殖等生物学行为的影响尚未见报道。本研究旨在通过诱导p204在VSMCs的过表达和沉默，观察VSMCs的增殖变化，探讨p204对VSMCs增殖的影响及其可能机制，为血管增殖性疾病的防治提供理论依据。

材料和方法

1 大鼠VSMCs的培养和实验分组

IFN－α购自北京三元基因工程有限公司;DMEM高糖型细胞培养液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自HyClone;α－SMA单克隆抗体(BM0002)、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒为武汉博士德公司产品;Control siRNA－A(sc－36869)购自 Santa Cruz;Ifi204 siRNA由宝生物工程(大连)有限公司合成，序列见表1;LipofectamineTM2000 Reagent购自Invitrogen。纯种SD大鼠(雌雄不拘)3只(购自第三军医大学实验动物中心)，体重120～140 g，按文献［6］介绍的方法进行胸主动脉平滑肌细胞的培养、纯化及鉴定。取4～6代细胞用于实验。实验分为5组，即阴性对照组(N组)、非特异性siRNA对照组(C组)、IFN－α诱导组(IFN组)、20%FBS+IFN－α组(F+I组)和Ifi204 siRNA转染组(siRNA组)。各组干预6 h，继续培养48 h收集细胞。

表1 siRNA及引物序列Table 1.The sequences of primers and siRNA

2 RT－PCR法检测mRNA表达

TRNzol总RNA提取试剂(DP405)、2×Taq PCR Master Mix(KT201)、100 bp DNA ladder购自北京天根公司;RT－PCR两步法试剂盒购自 TaKaRa(DRR047A);PCR扩增引物由宝生物工程(大连)有限公司合成(表1)。按TRNzol总RNA提取试剂盒说明操作提取总RNA，取1 μg按RT－PCR试剂盒说明书逆转录合成cDNA，取产物3 μL进行PCR循环，PCR扩增条件:94℃预变性3 min，94℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 1 min，扩增 30 个循环，最后 72℃5 min。反应结束后取PCR产物5 μL在2%琼脂糖凝胶中电泳分析，UVP800型凝胶成像系统成像。

3 Western blotting检测蛋白表达

p204抗体(sc－13367)购自 Santa Cruz;p21抗体(ab92675)购自Abcam;Tubulin抗体(AT819)购自碧云天;Western blotting marker(CW0021)购自北京康为世纪生物科技有限公司。按药立波主编的《医学分子生物学实验技术》介绍的方法进行蛋白样品的制备、定量、分离、转膜、印迹，从而测定特定蛋白的相对含量。

4 MTT检测细胞活力

四甲基偶氮唑盐［3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］购自 Sigma。收集对数生长期细胞，按细胞数3 000个/孔接种于96孔板，各组干预方法同上述实验。培养板用平板离心机4 000 r/min离心5 min，充分吸尽上清。每孔加入150 μL DMSO，置旋转摇床上低速振荡10 min，酶联免疫仪490 nm波长检测各孔吸光度(A)值。

5 流式细胞术检测细胞周期

细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(C1052)购自碧云天。按细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(C1052)说明书操作收集细胞、染色后采用配套软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

6 统计学处理

结 果

1 p204在VSMCs的基础表达和干预因素的影响

1.1 p204在 VSMCs的基础表达 RT－PCR和Western blotting显示，p204在VSMCs有一定丰度的基础表达，见图1、2。

Figure 1.Effect of intervention factors on the expression of p204 mRNA in VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.图1 干预因素对VSMCs p204 mRNA表达的影响

Figure 2.Effect of intervention factors on the expression of p204 protein in VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.图2 干预因素对VSMCs p204蛋白表达的影响

1.2 干预因素对p204表达的影响 与N组比较，IFN和F+I组p204 mRNA和蛋白表达上调(P＜0.05)，siRNA组p204mRNA和蛋白表达下调(P＜0.05)，而C组与N组的差异无显著，见图1、2和表2。

2 p204表达对VSMCs增殖的影响

2.1 p204表达对VSMCs活力的影响 与N组比较，IFN组、F+I组的MTT吸光度降低(P＜0.05)，siRNA组增高(P＜0.05)，而C组与N组的差异无统计学意义，见表2。

2.2 p204表达对VSMCs细胞周期的影响 与N组比较，IFN和F+I组的G0/G1期细胞增多，S期细胞减少(P＜0.05);siRNA组 G0/G1期细胞减少，S期细胞增多(P＜0.05);C组与N组的G0/G1期和S期细胞比较，差异无显著，见图3、表2。

3 p21表达的变化

3.1 p21mRNA水平的变化 RT－PCR结果显示，IFN组、F+I组的p21 mRNA表达较N组升高(P＜0.05)，siRNA组较N组减少(P ＜0.05)，C组与N组间差异不显著，见图4、表2。

表2 诱导p204过表达和沉默对VSMCs增殖和p21表达的影响Table 2.Effect of excessive expression and silencing of p204 on expression of p21 and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

表2 诱导p204过表达和沉默对VSMCs增殖和p21表达的影响Table 2.Effect of excessive expression and silencing of p204 on expression of p21 and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.*P ＜0.05 vs negative group.

p21mRNA p21protein N 0.99 ±0.03 0.34 ±0.07 0.67 ±0.06 83.79 ±1.96 1 Group p204 mRNA p204 protein MTT(A value)G0/G1stage(%) S stage(%)0.39 ±1.17 0.45 ±0.06 0.18 ±0.04 C 1.03 ±0.04 0.37 ±0.09 0.66 ±0.03 84.12 ±2.59 10.15 ±1.62 0.46 ±0.08 0.16 ±0.03 IFN 1.88 ±0.07* 0.81 ±0.09* 0.47 ±0.05* 91.33 ±2.09* 7.07 ±1.44* 0.72 ±0.04* 0.38 ±0.03*F+I 1.68 ±0.06* 0.75 ±0.08* 0.53 ±0.06* 89.53 ±2.82* 7.37 ±1.04* 0.70 ±0.07* 0.35 ±0.06*siRNA 0.21 ±0.05* 0.13 ±0.04* 0.88 ±0.04* 78.75 ±1.62* 16.52 ±2.07* 0.21 ±0.03* 0.08 ±0.02*

Figure 3.Effect of p204 expression on cell cycle of VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.±s.n=3.△P ＜0.05 vs negative group.图3 p204表达变化对VSMCs细胞周期的影响

Figure 4.Effects of p204 expression on p21 mRNA and protein in VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.图4 p204表达变化对VSMCs p21 mRNA和蛋白表达的影响

3.2 P21蛋白水平的变化 Western blotting结果显示，IFN组、F+I组的p21蛋白表达较N组增多(P＜0.05)，siRNA组较N组减少(P＜0.05)，见图4、表2。

讨 论

血管重塑是血管增殖性疾病的主要病理生理机制，在血管重塑的发生、发展过程中，VSMCs增殖、迁移以及血管基质的改变起着重要作用。

VSMCs的增殖是多阶段、多因子参与的精确、有序的调节过程。IFN是一组具有抗病毒、抗增殖、影响细胞生长和分化、调节免疫应答等众多生物学功能的活性细胞因子家族［7］。IFN与相应受体结合后，通过启动包括Janus激酶(Janus kinase，JAK)和信号转导子及转录激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)在内的一系列级联信号放大系统，诱导一系列IFN诱导蛋白的表达，从而发挥其抗病毒、影响细胞增殖等生物学效应［8］。IFN的抗病毒及免疫调节功效已经明确，而其调节细胞生长的功能，如抗增殖、促凋亡或存活、促进衰老和分化及抑制血管生成的作用及机制尚存在争议［7］。

有研究［9］显示，IFN－γ可调节细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)/细胞周期蛋白E(cyclin E)的活性及抑制E2启动子结合因子1(E2 promoter－binding factor 1，E2F－1)基因的表达而阻碍气道平滑肌细胞的G1/S转换，从而抑制该细胞的增殖。亦有文献［10］报道，p204通过不同机制影响骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、巨噬细胞的增殖或分化。但p204在VSMCs是否存在基础表达，对VSMCs增殖有无影响尚无研究报告。本研究结果显示，大鼠VSMCs存在基础水平的p204表达，且可被IFN－α诱导过表达，提示VSMCs可能也是p204调控增殖的靶细胞型。进一步研究发现，IFN－α干预可明显抑制VSMCs增殖，阻滞或延缓VSMCs细胞周期由G0/G1期进入S期;相反，转染针对p204 mRNA重要功能区域保守序列设计的特异性siRNA可明显下调p204 mRNA和蛋白水平，并促进VSMCs增殖，上调S期细胞比例，表明p204具有抑制大鼠VSMCs增殖的作用。同时，IFN－α可抑制FBS的促VSMCs增殖作用，并上调p204 mRNA和蛋白表达，也进一步证实IFN－α可通过上调p204表达抑制VSMCs增殖。

p21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的CIP/KIP家族成员，是哺乳类动物细胞中第一个被发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，其启动子上有p53的结合位点，是p53调节转录的靶基因。有研究［11］显示，p21具有抗增殖作用，参与细胞终末分化和衰老的调控。P21的表达除受p53转录调节外，也存在非p53依赖信号通路，如p200家族成员p202、STAT 信号转导通路等［12－13］。本研究结果显示，无论是诱导p204过表达还是沉默表达，p21的mRNA和蛋白水平均与p204呈一致性变化趋势。由于p204可通过其200个氨基酸的MF/LHATVAT/S模序介导与53BP1的结合而活化p53，结合本研究结果认为，p204抑制VSMCs和细胞周期进展的作用可能与促进p21表达有关。至于p204是否可通过非p53依赖通路直接与p21相互作用还有待进一步研究。

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