高脂血症大鼠下颌下腺内AQP1和AQP5表达及意义

崔芳芹 贾雪梅 汪 渊 黄大可 李 报

高脂血症大鼠下颌下腺内AQP1和AQP5表达及意义

崔芳芹1，4贾雪梅1＊汪 渊2黄大可3李 报3

1（安徽医科大学组织与胚胎学教研室，2分子生物学实验室，3形态学中心实验室，合肥 230032；4蚌埠医学院病理生理学教研室，安徽 233030）

目的 观察高脂血症大鼠下颌下腺内AQP1和AQP5表达的变化。方法 雄性S D大鼠20只，随机分为2组，对照组（C组）给予全价颗粒饲料喂养；高脂饮食组（H组）给予高脂饮食 （饲料成分为胆固醇2%、猪油10%、基础饲料88%）连续喂养2个月，各组动物均不限制饮水。2个月成模后，取血检测血脂；取大鼠下颌下腺组织，进行免疫组织化学染色（SP法）和计算机图像分析。结果 ①血脂检测结果：C组TG与H组TG比较有显著性差异（P＜0.05）；C组TC和H组TC比较有显著性差异（P＜0.05）。②免疫组化结果：C组大鼠下颌下腺AQP1平均光密度值与H组AQP1平均光密度值比较有差异性（P＜0.05）；C组大鼠下颌下腺AQP5平均光密度值与 H组AQP5平均光密度值比较有差异性（P＜0.05）。结论

高脂血症大鼠下颌下腺导管上皮细胞内AQP1和AQP5的表达减少，为探讨高脂血症导致下颌下腺分泌功能降低的病理机制提供了形态学依据。

高脂血症；水通道蛋白-1；水通道蛋白-5；下颌下腺；大鼠

高脂血症（hyperlipidemia，HLP）多发于中老年人，但随着我国社会经济的发展，人们生活方式和膳食结构的变化，青年人患本病者正在逐年增加［1］。该病对身体的损害是隐匿、逐渐、进行性和全身性的，高脂血症正成为吞噬人类健康的隐形杀手，其严重性不容忽视［2］。血脂异常对机体的影响主要表现在两方面：一是致动脉粥样硬化作用［3，4］及其继发损害，二是直接损害各组织器官［5，6］。目前研究较多的是高脂血症导致动脉粥样硬化［3，4］和肾结构及功能损伤［6］。高脂血症一般没有明显的临床症状，因此不易引起人们的重视，往往是在体检或其他检查时被发现。有些中医学者报道部分高脂血症患者伴口干、尿少、便秘及头晕等症状［5］，但其发病机制不清楚。众所周知，下颌下腺是三对大唾液腺之一，70%的唾液由下颌下腺分泌，其唾液分泌量下降可能是引起患者口干的主要原因之一。已有研究表明水通道蛋白-1（AQP1）和水通道蛋白-5（AQP5）与唾液腺的分泌功能关系密切，对调节水的转运率，维持唾液量的分泌起重要作用［7］。高脂血症是否能导致下颌下腺的分泌功能降低，目前尚未有相关报道。本实验用高脂饮食复制高脂血症大鼠模型，对其下颌下腺进行免疫组织化学染色，观察高脂血症大鼠下颌下腺内AQP1和AQP5表达及变化，以期为探讨高脂血症对下颌下腺分泌功能的影响提供形态学依据。

材料和方法

1.试剂

AQP1和AQP5的抗体和SP免疫组化试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

2.高脂血症动物模型复制及标本制备

雄性 S D大鼠20只，体重110-160g，（由安徽医科大学实验动物中心提供，普通级）。随机分为2组，对照组（C组）在室温及稳定湿度条件下，全价颗粒饲料喂养；高脂血症组（H组）给予高脂饮食 （饲料成分为胆固醇2%、猪油10%、基础饲料88%）。高脂血症的诊断标准，按照1997年中华心血管病杂志编辑委员会血脂异常防治对策专题组《血脂异常防治建议》［8］。检测禁食12-14小时后的血脂水平，凡血清总胆固醇≥5.72mmol／L （220mg／dl）或血清甘油三酯）≥l.70mmol／L （150mg／dl）者，可作为高脂血症动物模型复制。造模后，连续喂养2个月，在此期间各组动物均不限制饮食和饮水。2个月后，所有大鼠禁食12h，麻醉后剖开腹腔，迅速从腹腔静脉抽血5ml送检各组甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）水平。取出下颌下腺，用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片（厚度为4μm）。

3.免疫组织化学染色

采用免疫组织化学SP法染色。所用抗体及稀释度如下：一抗为兔抗鼠AQP1和AQP5的抗体，稀释度为1：100，37℃孵育40min后，置4℃ 过夜；二抗为羊抗兔IgG血清，37℃孵育15min；辣根酶标记链酶卵白素工作液（以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ），37℃孵育30min。标本用DAB显色后，脱水、透明和封片。

4.显微镜下判断

不着色为阴性 （-）；浅棕色为弱阳性（＋）；中等棕黄色为中等阳性 （＋＋）；深棕黄色为较强阳性（＋＋＋）；棕褐为强阳性（＋＋＋＋）。

5.计算机图像分析

在10×40倍光镜下，利用Nikon彩色数码CCD摄像头捕获各组下颌下腺免疫组化染色切片AQP1和AQP5的图像，每张切片随机选取5个视野，再用metamorph生物图像软件计算各组AQP1和AQP5免疫阳性细胞的平均光密度值（MOD）。

6.数据处理

所得数据经SPSS13.0软件进行处理，分析各组AQP1和AQP5免疫阳性细胞的平均光密度值（MOD），结果均用（（¯x±s）表示，组间差异采用q检验，P＜0.05有统计学意义。

结 果

1.血脂检查

C组TG与H组TG比较，有显著性差异（P＜0.05）；C组TC和H组TC比较，有显著性差异（P＜0.05）（表1）。

表1 两组大鼠组血清血脂水平比较（（¯x±s）（mmol／L）Table 1 The level of serum lipid in two groups（（¯x±s）（mmol／L）

2.免疫组织化学染色结果

免疫组化结果表明AQP1和AQP5在两组中均有不同程度的表达，C组大鼠下颌下腺AQP1和AQP5免疫反应阳性颗粒主要存在于颗粒曲管、纹状管等导管上皮细胞的胞浆内，呈强阳性反应（＋＋＋＋）（图1，图3）；与C组比较，H 组 AQP1和AQP5表达减少，呈中等阳性至弱阳性反应（＋＋-＋）（图2、图4）。AQP1蛋白表达水平在H组明显低于C组，两组大鼠下颌下腺AQP1平均光密度值比较，有显著差异性（P＜0.05）（表2）；AQP5蛋白表达在H组明显低于C组，两组大鼠下颌下腺AQP5平均光密度值比较，有显著差异性（P＜0.05）（表2）。

表2 两组大鼠AQP1、AQP5平均光密度值（MOD）的比较（¯x±s）Table 2 MOD of AQP1and AQP5positive cells in the submandibular gland of two groups（¯x±s）

讨 论

高脂血症（hyperlipidemia，HLP）是指各种原因所致血液中胆固醇、甘油三脂等脂质含量异常增高的一种全身脂代谢异常性疾病。其发生多与外源性脂质摄入过多或内源性脂质代谢紊乱有关。大量研究资料表明，高脂血症是脑卒中、冠心病和心肌梗死独立而主要的危险因素［9，10］。本实验中健康大鼠接受高脂饮食两月后其血中TG和TC明显增高，提示高脂血症大鼠动物模型造模成功。

AQP是近十年来发现的一族细胞跨膜蛋白，分子量为30kD左右。它们的发现从分子水平上揭示了水跨膜转运调节的基本机制。AQP在上皮细胞及内皮细胞含量较多，介导着不同类型细胞膜的跨膜水转运，参与水的分泌、吸收及细胞内外水平衡，对维持人体内水平衡有重要意义［11］。目前AQP1的蛋白结构研究的较清楚 ，它的一级结构为含6个螺旋的单肽链，连续跨膜6次，含3个胞外环（A、C、E）和2个胞内环（B、D），B环和 E环具有疏水性，B环位于细胞内侧，E环位于细胞外侧，其余3个环为亲水性，它们均存在细胞膜脂质层中，其氨基端 （NH2-）和羧基端 （COOH-）位于细胞内，整个AQP分子前后两部分在序列上相似，呈对称的镜像结构，并且B环和E环均具有天冬酰氨酸 -哺氨酸 -丙氨酸基本单元（APA），APA为 AQP家族的共有特征结构，对水的通透性具有决定性作用。AQP1在人体内分布广泛，主要选择分布在与液体分泌或吸收有关的上皮细胞或内皮细胞内，AQP1在涎腺导管上皮细胞中也广泛存在，参与唾液分泌调节。AQP5在唾液腺和泪腺中含量丰富，与唾液和泪液的产生有关［12］。肖林等［13］在研究干燥综合征（Sjogren，s Syndrome，SS）小鼠模型时观察到实验组6周后小鼠下颌下腺出现腺泡细胞变性、萎缩，导管腔狭窄，大量淋巴细胞浸润等结构变化，AQP1、AQP5表达显著下降，唾液分泌量严重减少，伴有明显的口腔干燥症状。杨军等［14］将外源性AQP1基因转染到SS模型小鼠的下颌下腺，发现AQP1基因表达被上调，同时伴有唾液分泌量增加，从而减轻了SS模型小鼠的口腔干燥症状。有学者向X线照射损伤的小鼠下颌下腺腺管内注射表达AQP1的腺病毒后，受损伤的腺管AQP1表达增加，同时唾液分泌量增加2-3倍。在1999年 Ma等［15］研究发现敲除AQP5基因的小鼠，经毛果芸香碱刺激，其唾液分泌量减少60%以上，从而推测AQP5在唾液分泌中起重要作用。在研究AQP5的调节方面，Smith等［16］研究口干症患者口服干扰素α对三对大涎腺的影响，进行细胞培养后，用 RT-PCR测定其AQP5mRNA的表达水平，再用 Western Blot技术证实IFN-α放大了AQP5在人类腮腺腺泡细胞中的转录，首次揭示了干扰素α能上调AQP基因的表达。上述研究结果表明AQP1和AQP5在下颌下腺唾液分泌功能起重要作用。

本实验研究结果表明高脂血症大鼠下颌下腺导管上皮细胞内AQP1和AQP5的表达明显低于对照组，从而提示高脂血症时下颌下腺内AQP1和AQP5表达减少，可能是导致下颌下腺分泌功能下降的重要原因之一，也可能对中医学者报道的部分高脂血症患者伴有口干的症状加以解释。目前，HLP大鼠下颌下腺AQP1和AQP5表达减少的原因尚不清楚，我们分析可能与以下因素有关：①内源性NO是体内一种重要的气体信号分子。它通过舒张血管，调节血压，改变局部血流和抑制血小板聚集等作用，参与各脏器微循环的调节［17］。江一峰等［18］研究发现高脂血症时，过高的胆固醇和LDL浓度降低了eNOS的mRNA转录速率及其稳定性。当血液中的脂质浓度长时间处于较高水平时 ，eNOS的表达下调使NO生成减少，导致血管舒张功能受到影响 ，血液循环的阻力增加 ，下颌下腺血流量降低，引起组织缺血缺氧，导致AQP的合成减少。②高脂血症时游离脂肪酸 （FFA）和甘油三酯 （TG）的升高是导致胰岛素抵抗的重要原因［19］，使葡萄糖的代谢障碍，致机体合成AQPs所需能量供应不足；③高血脂可以激活多种炎症细胞，产生TNFa等炎症细胞因子异常［20］，已有研究表明导TNFa能下调AQPs的基因表达［21］。④由高脂血症所致的脂代谢紊乱性疾病的发展，目前认为与氧自由基所致的脂质过氧化损伤关系密切。高血脂激活蛋白激酶C，FFA［22］释放增多，诱导氧自由基生成，同时也导致脂质过氧化反应产生大量的自由基，可直接损伤DNA，导致 AQPs的基因表达调控失衡［23］。AQP的研究起步较晚，其结构及转运确切机制尤其是AQP的调节机制尚不十分清楚，有待近一步深入研究。

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图 版 说 明

图1 正常大鼠下颌下腺颗粒曲管（1A）和纹状管（1B）上皮细胞的胞浆呈AQP1免疫反应强阳性，（SP×400）。

图2 高脂血症大鼠下颌下腺颗粒曲管（2A）和纹状管（2B）上皮细胞的胞浆呈 AQP1免疫反应弱阳性，（SP×400）。

图3 正常大鼠下颌下腺颗粒曲管（3A）和纹状管（3B）上皮细胞的胞浆呈AQP5免疫反应强阳性，（SP×400）。

图4 高脂血症大鼠下颌下腺颗粒曲管（4A）和纹状管（4B）上皮细胞的胞浆呈AQP5免疫反应中等阳性，（SP×400）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Strong positive immuoreactivity of AQP1in epithelial cells of control group，granular convoluted tubule（1A），striated ducts（1B）（SP×400）

Fig.2 Lower positive immuoreactivity in of AQP1in epithelial cells of H group，granular convoluted tubule（2A），striated ducts（2B）（SP×400）

Fig.3 Strong positive immuoreactivity of AQP5in epithelial cells of control group，granular convoluted tubule（3A），striated ducts（3B）（SP×400）

Fig.4 Middle positive immuoreactivity in of AQP5in epithelial cells of H group，granular convoluted tubule（4A），striated ducts（4B）（SP×400）

Study on expression of AQP1 and AQP5 in the Submandibular glands of hyperlipidemia rats

Cui Fangqin1，4，Jia Xuemei1＊，Wang Yuan2，Huang Dake3，Li Bao31（Department of Histology and Embryology；2Molecular Biology Lab；3Morphological Central Lab ，Anhui Medical University，Hefei 230032，Anhui；4Department of Pathophysiology，Bengbu Medical College，Anhui，233030，China）

ObjectiveTo investigate the expression and significance of AQP1and AQP5in the submandibular glands of hyperlipidemia rats.MethodsTwenty rats were randomly divided into two groups，10rats each.The control group（group C）was given the grain diet，the hyperlipidemia group（group H）was given high-fat diet（cholesterol 2%，lard 10%and based feed 88%），both drinking water freely.After 2months，all rats were killed for assaying blood serum lipids，then the submandibular glands were taken for observing the results using immunohistochemical staining and image analysis .Results ①The differences in TG and TC between group were significant（P＜0.05）；the difference between TC of C group and TC of H group was significant（P＜0.05）.② The differences in the MOD of AQpland AQP5 between group C and H were significant（P＜0.05）.ConclusionThe expression of AQP1and AQP5is down-regulated in the submandibular glands of hyperlipidemic rats，which provides morphological evidence for the reduced secretory function of the submandibular glands of hyperlipidemia rats.

Hyperlipidemia；Aquaporin-1；Aquaporin-5；Submandibular Gland；Rats

R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.016

2011-08-10

2011-11-28

蚌埠医学院院课题基金（BY1004）

崔芳芹，女（年），讲师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）