BRCA1、PTEN、Rb、C-myc和C-myb在乳腺癌中的异常表达及临床意义探讨

赵云霞 龚晓萌 刘德纯 承泽农 赵 瑾

BRCA1、PTEN、Rb、C-myc和C-myb在乳腺癌中的异常表达及临床意义探讨

赵云霞 龚晓萌1刘德纯1承泽农1赵 瑾

（蚌埠医学院病理生理学教研室；1蚌埠医学院病理学教研室 安徽233030）

目的 探讨BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白异常表达在乳腺癌发生、发展中的作用及其临床意义。方法应用免疫组织化学S-P法检测150例乳腺癌、20例不典型增生和30例良性增生性病变组织中BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白的表达；结合临床病理指标进行分析。结果 乳腺癌组织和不典型增生组织中BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白表达与良性增生性病变组织中表达均具有显著性差异（P＜0.05）。BRCA1蛋白失表达率随乳腺癌组织学分级的增高而增高，在年龄＜50岁和ER（雌激素受体）阴性时BRCA1蛋白失表达率增高。PTEN蛋白的失表达与淋巴结转移、ER失表达有关（P＜0.05）。Rb蛋白在乳腺癌Ⅲ级中失表达率较高，但无统计学差异（P＞0.05）。C-myc蛋白的过表达与组织学分级、淋巴结转移及病理类型有关（P＜0.05）。C-myb蛋白的过表达与乳腺癌组织学分级有关（P＜0.05）。结论 BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白异常表达均在乳腺癌的发生过程中起作用；PTEN、C-myc、C-myb蛋白的异常表达参与了乳腺癌的浸润和转移。

乳腺癌；免疫组织化学；癌基因；抑癌基因

乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，自上世纪90年代以来，全球乳腺癌的发病率提高了10倍［1］。在我国，乳腺癌已成为危害妇女健康的主要恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤发病率之首，已近30／10万，全国乳腺癌平均死亡率约为3／10万，且发病率和死亡率仍有增高趋势［2］，对本病的防治不容忽视。目前的研究表明，肿瘤从遗传学的角度上来说是一种基因病。各种环境和遗传的致癌因素引起细胞非致死性的DNA损伤，从而激活原癌基因和灭活抑癌基因，继而引起其表达的异常，使靶细胞发生恶性转化。迄今，乳腺癌相关基因在乳腺癌发生、发展中的作用尚不明确，本研究旨在探讨 BRCA1、PTEN、Rb、C-myc和C-myb在乳腺癌中的表达状况，并与其它较为确定的预后指标相比较，结合临床病理资料进行分析评价，为肿瘤的预后判断和防治提供科学依据。

材料和方法

1.研究对象

标本来源于蚌埠医学院病理学教研室（蚌埠医学院第一附属医院病理科）2004年至2006年手术切除乳腺组织存档蜡块标本，其中乳腺癌组织标本150例，所有患者均接受手术治疗，术前未接受过化疗、内分泌或放射治疗，经病理确诊，且外检已做过ER、PR 检测。年龄30-80岁，平均年龄47.45岁（中位数49岁），＜50岁者81例，≥50岁者69例。浸润性导管癌（非特殊性）121例；浸润性小叶癌14例；导管原位癌13例；髓样癌2例。将浸润性导管癌121例按照 WHO提供的方法进行分级［1］，其中Ⅰ级16例；Ⅱ级84例；Ⅲ级21例。按长径计算，肿块最小者0.8cm，最大者15cm。按TNM 分类［1］，肿瘤大小分为3组，T1期肿瘤最大直径≤2.0cm者57例；T2期肿瘤直径为2.0-5.0cm 者82例；T3期肿瘤最大直径＞5.0cm者11例。本组病例中含有腋淋巴结清扫的病例95例，其中有58例发生转移；未转移者37例。ER、PR检测结果以外检中免疫组织化学（SP法）报告结果为准。ER阳性61例，ER阴性89例；PR阳性54例，PR阴性96例。标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，常规制片。随机选择30例乳腺良性增生性病变标本作为对照。

2.方法和试剂

采用免疫组织化学S-P法，分别行BRCA1，PTEN，Rb，C-myc 和 C-myb 标 记。 鼠 抗 人BRCA1单克隆抗体（克隆系：MS110，工作浓度1：40），鼠抗人PTEN单克隆抗体（克隆号：17A），鼠抗人Rb单克隆抗体（克隆系：1F8），鼠抗人C-myc单克隆抗体（克隆系：9E／11），鼠抗人C-myb单抗体抗体（克隆系：4E3）及相关试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。严格按照免疫组织化学SP实验步骤进行，用已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

3.结果判断

BRCA1、Rb蛋白阳性表达定位于细胞核，PTEN、C-myb蛋白阳性表达定位于细胞质，C-myc蛋白阳性表达主要定位于细胞核，以胞核或胞质出现明显的黄色或棕黄色颗粒视为阳性着色。判定标准：以染色强度和阳性细胞比例评定阳性表达。细胞胞质或胞核出现定位明确、染色明显的棕黄／棕褐色颗粒为阳性细胞。所占比例＞10%为阳性病例。

4.统计学处理

采用SPSS13.0统计软件包进行分析，采用χ2检验和Fisher精确检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1.BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白在乳腺癌、乳腺不典型增生及乳腺良性增生性病变组织中的表达

BRCA1蛋白在良性增生性病变（对照组）中均有表达，乳腺不典型增生中失表达率为15.0%，乳腺癌中失表达率为12.7%，两组均有显著性差异（P＜0.05）（表1，图1）。PTEN蛋白在乳腺癌中失表达率为65.2%，乳腺不典型增生中失表达率为50.0%，高于对照组的13.3%（P＜0.05）（表1，图2）。Rb蛋白在乳腺癌中阴性表达例数为71例（47.3%），乳腺不典型增生中阴性表达率为40.0%，明显高于对照组（P＜0.05）（表1，图3）。C-myc在乳腺癌中阳性表达率为56.7%，乳腺不典型增生中阳性表达率为45.0%，均高于良性增生性病变组的阳性表达率16.7%（P＜0.05）（表1，图4）。C-myb蛋白在乳腺癌组阳性表达率为63.3%，乳腺不典型增生组阳性表达率为65.0%，显著高于对照组（P＜0.05）（表1，图5）。

表1 BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白在乳腺癌、乳腺不典型增生及乳腺良性增生性病变组织中的表达（n）Table 1 Expression of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb proteins in breast cancer，breast atypical hyperplasia and breast benign proliferative lesion tissues

2.乳腺癌中BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白表达与临床病理指标的关系

BRCA1蛋白失表达与所列出的各临床病理指标间均无显著性差异（P＞0.05）。但其失表达率随组织学分级增高而增高，在组织学Ⅰ级中无阴性病例，Ⅱ级、Ⅲ级中失表达率分别为9.5%和19.0%。在ER阴性和年龄＞50的病例中，BRCA1蛋白失表达率较高，但无统计学意义。PTEN蛋白表达缺失与淋巴结转移、ER表达相关（P＜0.05）。Rb蛋白表达与各临床病理指标均不具有相关性（P＞0.05），只是在组织学分级中其表达缺失率随分级增高而增高，组织学Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级中表达缺失率分别为37.5%（6／16）、48.8%（41／84）和71.4%（15／21）。C-myc蛋白表达与乳腺癌组织学分级、组织学类型、及淋巴结转移均有明显关系（P＜0.05）。C-myb蛋白表达与乳腺癌组织学分级有关系（P＜0.05）。（表2）。

表2 BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白表达与乳腺癌临床病理指标的关系（n）Table 2 Correlation between expression of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc，C-myb and Clinicopathological features in breast cancer（n）

与组织学分级Ⅰ、Ⅱ级比较①P＜0.05；与淋巴结转移阳性组比较②P＜0.05；与原位癌组比较③P＜0.05；与ER表达阳性组比较④P＜0.05。

讨 论

BRCA1作为一种DNA结合蛋白，在正常乳腺上皮细胞核内起重要的转录调控作用，参与细胞周期调控及DNA损伤修复，抑制细胞进入增殖周期，阻止分裂，促进终末分化，诱发细胞凋亡，为一种重要的细胞周期负调控因子［3］。以往认为BRCA1作为一种抑癌基因，只在遗传性乳腺癌中起作用，散发性乳腺癌中BRCA1基因突变非常罕见，甚至不存在。但近期研究表明，BRCA1基因突变在散发性乳腺癌中也起作用。本组研究结果与国内赖春宁［4］、杨举伦［5］研究相一致。研究结果提示，BRCA1蛋白在无家族史选择的病例中有一定的失表达率，表明BRCA1突变在散发性乳腺癌中同样起着重要作用。BRCA1相关的家族性乳腺癌与更高的组织学分级和增殖活性明显相关［6］。BRCA1过度表达会抑制雌激素受体的活化，在与BRCA1有关的肿瘤中往往有P53突变和ER阴性表现，所以BRCA1可能在较大程度上依赖P53或ER而发挥肿瘤抑制活性［7］。本研究中，BRCA1蛋白的失表达率随组织学分级的增高而具有增高趋势；在ER阴性病例中BRCA1蛋白失表达率高于ER阳性病例；在年龄＜50岁组BRCA1蛋白失表达率高于年龄≥50岁组，提示BRCA1蛋白表达缺失与乳腺癌恶性程度、年轻发病及预后差有一定关系。BRCA1蛋白失表达率乳腺不典型增生组明显高于对照组，以及其在原位癌组中的突然增高，提示BRCA1蛋白的改变在乳腺癌的发生中具有重要意义。关于散发性乳腺中BRCA1失表达与临床病理参数的研究报道甚少，尚需要更多病例的研究证实。本研究显示，BRCA1蛋白的失表达在散发性乳腺癌中同样提示乳腺癌发病风险，并对乳腺癌预后判断具有一定指导意义。

PTEN是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN通过其磷酸酶活性调节细胞内多种信号转导途径，从而调控细胞周期，促进细胞凋亡，抑制细胞生长。当PTEN基因发生突变后，其异常产物不具有上述功能，而失去了对细胞生长的负调控作用。Sano等［8］首先运用卡-迈两氏存活点检测发现PTEN蛋白表达高低与胶质瘤病人的病理分级及预后有关。病人预后越差，恶性程度越高，PTEN蛋白表达水平越低。本研究结果显示PTEN蛋白失表达乳腺不典型增生组明显高于对照组，且其与有无淋巴结转移、雌激素受体状况有关，提示PTEN基因突变在乳腺癌的发生中具有重要意义，并使肿瘤更具有侵袭和转移能力，更容易发生淋巴结转移。肿瘤ER阳性表达是乳腺癌对激素治疗敏感，预后较好的独立预后指标。PTEN蛋白失表达时往往伴有ER表达缺失，提示PTEN基因改变是乳腺癌预后较差的指标。上述研究结果与国内外多数报道［9，10］相符合。因此，我们认为PTEN在乳腺癌发生、浸润、转移过程中均具有重要作用，它是乳腺癌预后差的重要指标之一。联合检测PTEN与其它预后指标，对预测乳腺癌预后更有指导意义。

Rb基因是最早被克隆的肿瘤抑制基因，也是细胞周期中校验点的关键因子［11］。国内外关于Rb与乳腺癌关系的研究罕有报道。国外研究显示，乳腺癌中Rb蛋白的表达下调或失表达率为17%-46%［12］。本实验结果显示，Rb蛋白失表达乳腺不典型增生组明显高于对照组，Rb蛋白在乳腺癌中的失表达率为47.3%，提示Rb基因蛋白的表达缺失在乳腺癌发生中具有重要意义。Rb蛋白与临床病理参数的比较发现，Rb蛋白的失表达与各临床病理参数均无关。但在组织学Ⅲ级中Rb基因蛋白失表达有明显增高，此结果提示，Rb基因的改变在高级别乳腺癌发展中具有重要作用，或在低级别乳腺癌向高级别乳腺癌过渡中发挥作用。Dublin等［12］的研究也显示，Rb蛋白的失表达率在组织学Ⅲ级中乳腺癌中有增高趋势。本实验结果提示，Rb蛋白失表达在乳腺癌的发展中可能起重要作用，Rb蛋白的检测结果可能反映乳腺癌的恶性程度。

C-myc基因是发现较早的原癌基因之一。其编码蛋白具有转录因子活性，有促进细胞增殖、调节细胞周期、抑制细胞分化、参与细胞凋亡的作用。国外报道在女性乳腺癌中C-myc基因扩增率在15.7%-25.0%不等，过度表达的阳性率为22%-45%［13］。国内报道P62C-myc在乳腺癌中的阳性表达率高于国外，为50%-65%，本实验结果与之相一致。P62C-myc在乳腺不典型增生病变中已有较高表达，提示C-myc在肿瘤发生的早期已被激活，它参与了肿瘤发生发展的整个过程。Rao［14］等认为C-myc在良性增生、非典型增生、乳腺癌中的基因扩增是逐渐递增的。关于与临床病理指标关系的报道［15，16］很少且差异较大，但均提示，C-myc基因扩增在乳腺癌的发生、发展过程中具有重要的作用。有研究认为，在乳腺癌中标记肿瘤内部异质性的是C-myc和cyclinD1的扩增，而不是c-erbB-2的扩增［17］。这从侧面证明，C-myc基因扩增在乳腺癌的发展中起着重要作用。本研究显示，P62C-myc的表达与乳腺癌分级、淋巴结转移、病理类型相关。组织学分级高低、淋巴结有无转移、肿瘤是否浸润是肿瘤恶性程度及预后的判断指标。由此我们认为C-myc过表达与乳腺癌预后不良密切相关，且P62C-myc表达不受ER及PR状况的影响，提示P62C-myc蛋白表达可能是乳腺癌重要的独立预后标记因子。

C-myb编码的蛋白质为核内转录调节因子，参与细胞增殖与分化的调控。有关C-myb与胶质瘤关系的研究有少数报道，认为C-myb表达水平与胶质瘤的级别有关，C-myb基因突变在胶质瘤发生发展中起到重要作用［18］。关于C-myb与乳腺癌的研究未见有报道。本研究结果提示C-myb蛋白在乳腺癌中有较广泛的表达，具有重要作用，在乳腺不典型增生中也有较高表达，提示C-myb在肿瘤发生的早期已被激活。乳腺癌中C-myb蛋白表达与临床病理参数的关系分析可知，C-myb蛋白的阳性表达与组织学分级有关，且随组织学分级的增高，C-myb蛋白的阳性率增高。此结果提示，C-myb与乳腺癌细胞的分化有关。C-myb蛋白的高表达是乳腺癌恶性程度高的标志。

总之，本研究显示BRCA1、PTEN、Rb、C-myc、C-myb蛋白异常表达均在乳腺癌的发生过程中起作用；PTEN、C-myc、C-myb蛋白的异常表达参与了乳腺癌的浸润和转移。联合检测上述指标对乳腺癌的早期发现和预后判断具有指导意义。

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图 版 说 明

图1 乳腺癌中BRCA1阳性表达定位于胞核（SP法×100）

图2 乳腺癌中PTEN阳性表达定位于胞质（SP法×100）

图3 乳腺癌中Rb阳性表达定位于胞核（SP法×100）

图4 乳腺癌中C-myc阳性表达定位于胞核（SP法×100）

图5 乳腺癌中C-myb阳性表达定位于胞质（SP法×100）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Expression of BRCA1in cell nucleus of mammary carcinoma （SP method×100）

Fig.2 Expression of PTEN in cell plasmas of mammary carcinoma （SP method×100）

Fig.3 Expression of Rb in cell nucleus of mammary carcinoma （SP method×100）

Fig.4 Expression of C-myc protein in cell nucleus1of mammary carcinoma（SP method×100）

Fig.5 Expression of C-myb in cell plasmas of mammary car - cinoma （SP method×100）

Aberrant expression of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb and its clinical significance in breast cancer

Zhao Yunxia，Gong Xiaoming1，Liu Dechun1，Cheng Zenong1，Zhao Jin
（Department of Physiopathology；1Department of pathology，Bengbu Medical College，Anhui 233030，China）

ObjectiveTo investigate the roles of aberrant expression of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb in the development of breast cancer and its clinical significance.MethodsImmunohistochimistry（S-P method）was used to detect proteins of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb in 150cases of breast cancer，20cases of atypical hyperplasia and 30cases of benign proliferative lesions.The data was analyzed together with their relation to clinical pathological parameters.ResultsThe expressions of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb proteins had statistical difference between breast cancer and benign proliferative lesions，as well as between atypical hyperplasia and benign proliferative lesions（P＜0.05）.The negative rate of BRCA1protein increased with histological grade，younger age（＜50）and negative expression of ER.The loss of expression of PTEN protein was related with lymph node metastasis and the loss of ER expression（P＜0.05）.The loss of expression Rb protein was higher in breast cancer gradeⅢ，but with no statistical difference （P＜0.05）.Overexpression of C-myc protein was correlated with histological grade，lymph node metastasis and pathological type（P＜0.05）.Overexpression of C-myb protein was correlated with histological grade （P＜0.05）.ConclusionAberrant expressions of BRCA1，PTEN，Rb，C-myc and C-myb proteins play biological role in breast cancer development.Aberrant expressions of PTEN，C-myc and C-myb proteins are correlated with invasion and metastasis of breast cancer.

Breast cancer；Immunohistochimistry；Oncogenes；Anti-oncogenes

R737.9

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.013

2011-08-05

2011-10-28

安徽省教育厅高校青年教师基金（2007jq91133）

赵云霞，女（1977年），汉族，讲师。