两种有胃鱼消化道6种内分泌细胞的免疫组织化学比较研究

金显文 黄 山 吴孝兵

两种有胃鱼消化道6种内分泌细胞的免疫组织化学比较研究

金显文1黄 山2吴孝兵3＊

（1淮北师范大学生命科学学院 ；2淮北师范大学体育学院 安徽235000；3安徽师范大学生命科学院 芜湖241000）

目的 应用6种胃肠激素抗血清对胡子鲶（Clarias fuscas）和瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli Richardson）消化道内分泌细胞进行了免疫组织化学比较。方法 应用链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物技术（streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC法）免疫组织化学方法。结果 除胡子鲶后肠外，五羟色胺细胞在两种鱼的消化道各段均有分布，其中贲门部或幽门部密度最高，前中肠次之，食道最少；胡子鲶消化道中生长抑素细胞主要分布于胃贲门部和胃部，食管、胃幽门及肠道内未见分布，而瓦氏黄颡主要分布于食管和胃部，肠道内未见分布；胃泌素细胞在胡子鲶消化道内只在肠内检测到，瓦氏黄颡只在幽门胃和前肠两个部位检测到；胰多肽细胞只在瓦氏黄颡的幽门胃和前肠两个部位有分布；胰高血糖素和P-物质两种细胞在两种鱼的消化道各段均未见其分布。结论 两种有胃鱼消化道中六种内分泌细胞的分布既有一定的共性，体现了两者消化生理的共同点；同时又存在较大的种间差异，与各自食性及生活环境相适应。

胡子鲶；瓦氏黄颡鱼；消化道；内分泌细胞；免疫组织化学

国内外学者对鱼类胃肠道内分泌细胞的鉴别和定位已作了大量的研究工作，在硬骨鱼类胃肠中先后发现了15种免疫活性内分泌细胞［1］，应用免疫组织化学方法对鱼类胃肠道内分泌细胞进行定位研究已有一些报道［2-20］，这些研究表明，鱼类消化系统中免疫活性内分泌细胞的种类和分布型非常复杂，充分显示其在鱼类消化道中分布的多样性。胡子鲶（Clarias fuscas）和瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli Richardson）瓦氏黄颡鱼同属鲶形目（Siluriformes），其肉质细嫩、营养丰富、经济价值极高，是极具市场潜力的养殖品种。本实验应用6种抗哺乳动物血清对胡子鲶和黄颡鱼胃肠道内分泌细胞进行免疫组织化学定位研究，旨在进一步丰富鱼类消化道比较内分泌学资料，为其营养和消化生理以及人工饲料的科学配方研究提供基础资料。

材料和方法

1.材料

胡子鲶和瓦氏黄颡鱼雌雄各5尾，2007年5月购自安徽省芜湖吉合菜市场。置于清水中暂养24小时后迅速解剖，按下列消化道各段取材：食道、胃贲门部、胃体、胃幽门部、前肠、中肠和后肠。生理盐水洗净，用无冰醋酸的Bouin氏液固定18-24h，常规脱水透明，石蜡包埋，切片5-6μm，贴片，370C温箱烘干备用。

2.主要试剂

6种胃肠激素的兔抗血清详见表1，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（Streptavidin peroxidase，SP）免疫组织化学试剂盒购于北京中杉生物技术公司。

3.免疫组织化学方法

本实验采用S-P（Streptavidin peroxidase）免疫组织化学法。常规石蜡切片脱蜡至水。3%H2O2甲醇溶液孵育5min，消除内源性过氧化物酶的活性。蒸溜水浸洗，PBS浸泡5min，滴加正常山羊血清（1∶10）室温孵育10min，封闭非特异性反应部位。倾去血清，滴加一抗，4℃过夜。PBS浸洗3次×5min，滴加即用型生物素标记的二抗（羊抗兔IgG抗血清），室温孵育15min，PBS浸洗3次×5min，滴加即用型链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温孵育15分钟。PBS浸洗3次×5分钟，DAB-H2O2显色，自来水洗净，脱水，透明，封片。阴性对照分别用正常羊血清和PBS代替一抗，其余步骤同上。

表1 胃肠激素抗血清一览表Table 1 Details of the gut hormone anisera

4.观察与计数

在OlympusBX51系统显微镜下观察，拍照，并对每个部位的切片随机取10个400倍视野下计数，用平均值±标准差（¯x±SD）表示内分泌细胞的分布密度，并对同一种内分泌细胞在消化道不同部位的分布密度用Duncan多重比较的方法进行统计学分析，同时又对消化道的不同部位的内分泌细胞的分布密度用统计学方法进行t检验（用SPSS11.0统计分析软件）。

结 果

光学显微镜下，两种有胃鱼消化道具有典型的四层结构，免疫阳性细胞DAB-H2O2显色呈深棕色，与浅蓝或淡黄色背景容易区分。阴性对照切片均未见深棕色细胞。雌雄个体间内分泌细胞种类及分布无差异，所有对照片均为阴性。6种胃肠激素抗血清在胡子鲶和黄颡鱼消化道显示的内分泌细胞种类及分布密度见表2。

表2 胡子鲶和瓦氏黄颡鱼消化道内分泌细胞的分布密度（个／400倍视野）Table 2 distribution and density of the endocrine cells in the digestive tract ofClarias fuscas and Pelteobagrus vachelli（unit／400times visiual field）

1.5 -HT-IR

结果表明，五羟色胺免疫活性细胞（5-hydroxytryptamine immunoreactive，5-HT-IR）在胡子鲶消化道各段除后肠外均有分布，以胃幽门部和中肠密度最高（P＜0.05），胃体、胃贲门部其次，前肠和中肠部较少，食道和前肠最少；在瓦氏黄颡鱼消化道各段都有分布，以胃贲门部密度最高（P＜0.05），胃体、胃幽门部其次，前肠和中肠部较少，食道和直肠最少，分布差异显著（P＜0.05）。食道和肠5-HT-IR细胞主要位于上皮细胞之间，细胞呈椭圆形、楔形或长梭形（图1、2、4、5），有的细胞有较长的胞突伸向肠腔（图3）。胃5-HT-IR细胞主要分布于胃腺部，在腺泡外围或腺上皮之间，胃上皮中偶见（图8、9）。细胞呈圆形、椭圆形或楔形，有的细胞有较长的胞突伸向邻近细胞，胞突中可见囊状膨大（图6、7、10）。

2.SS-IR

生长抑素免疫活性细胞（synthetic cyclic somatostatin immunoreactive，SS-IR）胡子鲶消化道中只分布于贲门胃及胃体部分，分布密度差异均不显著（P＞0.05），食管、幽门胃及肠道中未见；在瓦氏黄颡鱼消化道中主要分布于食管和胃，幽门部最多，胃体部分最少，各段分布差异显著（P＜0.05），肠道中未见。SS-IR细胞主要分布于胃粘膜上皮细胞之间，细胞多呈椭圆形或梭形（图11、12），游离端也有突起伸向胃腔。

3.Gas-IR

胃泌素免疫细胞（gastrin immunoreactive，Gas-IR）分布在胡子鲶的肠道中，自前肠往后逐渐减少，各段分布差异显著（P＜0.05）；瓦氏黄颡鱼只少量地分布在幽门和前肠处，分布密度差异均不显著（P＞0.05）。细胞主要位于上皮细胞与杯状细胞之间，多呈细长形或不规则形，有的可见游离端有胞突伸向肠腔（图13、14、15）。

4.PP-IR

胰多肽细胞（Pancreatic Polypeptide immunoreactive，PP-IR）只分布在瓦氏黄颡鱼的胃幽门部和前肠，分布密度差异显著（P＜0.05）。多数椭圆形，位于上皮基部或粘膜下层，少数呈蝌蚪状且具有单个胞突；在胡子鲶消化道中则未见分布。

5.Glu-IR和SP-IR

胰高血糖素（Glu-IR）和P-物质（SP-IR）二种免疫活性细胞两种鱼消化道各段均未检出阳性细胞。

讨 论

5-HT-IR细胞是存在于神经系统和胃肠道的一种重要的神经递质和胃肠激素。研究发现，当胃肠壁受到化学和物理剌激时，5-HT-IR细胞分泌5-HT释放到胃肠腔，刺激和增进胃肠的蠕动［14］。5-HT-IR细胞在鱼类胃肠道的分布情况，有胃真骨鱼和无胃真骨鱼存在很大差别。5-HT-IR细胞在几种无胃鱼的肠道中均未发现［3，4］，而有胃鱼的消化道虽均有分布，但分布特点各有不同。黑鲷（Sparus macrocephalus）［5］、花 鲈 （Lateolabrax japonicus）［6］分布在食管和胃中，肠道中未见分布，大弹涂鱼（Periophthalmus cantonensis）在食管、贲门胃和后肠中有分布［7］，而黄鳝（Monopterus albus）仅在幽门部见到［8］。本试验中，除胡子鲶后肠外两种有胃真胃鱼消化道各段均有5-HT-IR细胞分布，这与黄鳍鲷（Sparus latus）［9］、日本鳗鲡 （Anguilla japonicus）［10］、鳜 鱼 （Siniperca chuatsi）［11］、欧 洲 鳗 鲡（Anguilla anguilla L）［12］和 褐 牙 鲆 （Paralichthys olivaceus）［13］等种类相似，而且5-HT-IR细胞大都集中在有胃鱼胃肠道幽门部，随后分布密度逐渐降低，本实验也证明了这点，说明除了胃和前肠是消化食物的主要场所，在瓦氏黄颡鱼和胡子鲶等有胃真骨鱼消化道中，中肠仍有着重要的消化功能。胡子鲶和瓦氏黄颡鱼同属鲶形目，但前者消化道各段的平均密度比后者大，且后肠未见分布，这可能与胡子鲶贪食且喜食腐蚀质食物有一定的关系。5-HT细胞有突起伸向邻近细胞或肠腔，其可能通过旁分泌、外分泌的方式释放而发挥其调节作用。

SS-IR细胞在有胃鱼类消化道的分布已有一些报道，但分布型亦有差别。黑鲷［5］、大弹涂鱼［7］SSIR细胞仅存在食管和胃体的前部，幽门部和肠道中未见分布，这与本实验两种有胃鱼的分布相似，Rombout等人也曾做大量研究并认为SS-IR细胞仅存在于有胃真骨鱼类的胃中［15］。但日本鳗鲡、鳜鱼、欧洲鳗鲡、鲻鱼（Mugil cephalus L）整个胃肠道均有SS-IR细胞分布［10-12，16］。但在有胃鱼鲇（Silurus asotus）、乌鳢（Channa argus）和大口黑鲈（Micropterus salmoides）的食管和胃各部消化道黏膜则均未见到SS-IR细胞［17］。SS的生理作用是当胃pH值下降时，SS-IR细胞受刺激而释放生长抑素，从而抑制G细胞释放胃泌素，降低壁细胞的胃酸分泌等［14］。胡子鲶和瓦氏黄颡鱼消化道SS-IR细胞的分布特点，对胃肠道激素分泌和抑制活动达到动态平衡起重要的调节作用。

Gas-IR细胞在鱼类消化道分布的研究报道较多。几种鲤科鱼类的肠道中，Gas-IR细胞大多位于前 肠 前 段［4，18，19］；在 有 胃 鱼 鳜 鱼、大 口 黑 鲈 （Micropterus salmoides）、尼罗非鲫（Oreochromisniloticus）和短盖巨脂鲤（Colossoma brachypomum）胃肠道中均未发现 Gas-IR 细胞［11，17，20］，而日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、鲻鱼、乌鳢的胃肠道均有Gas细胞分布［10，12，16，17］。在本 实 验 中 胡 子 鲶 胃 肠 道 中 Gas-IR细胞分布仅在肠道中出现而瓦氏黄颡鱼仅分布在幽门和前肠中，Gas细胞可能感受肠腔内容物的刺激而产生外分泌作用。

PP-IR细胞在胡子鲶消化道各段均未检出阳性细胞，这与黑鲷、欧洲鳗鲡和花鲈胃肠道的情况相同［5，6，12］，瓦氏黄颡鱼与黑鲷、花鲈相同分布在前肠和中肠中［5，6］，可能与这些鱼的胃容量小有关，通过内分泌活动来促进胃排空以增加进食频率有关。但在大弹涂鱼［7］及黄鳍鲷［9］的幽门部、前肠及中肠中有PP-IR细胞的分布。

本实验中的两种有胃鱼胃肠道中Glu-IR、SPER细胞未检出阳性细胞，这与黄鳝［8］、日本鳗鲡［10］、鳜鱼［11］以及欧洲鳗鲡［12］一致。

综上所述，胡子鲶和瓦氏黄颡鱼胃肠道内分泌细胞的分布既存在一定的共同点，体现了两种鱼消化生理的某些共同之处，同时由于栖息环境、食性等方面的适应性差异，消化道内分泌细胞在动物消化道中的存在与分布有很大的种的特异性。

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图 版 说 明

图1 食道圆形5-羟色胺细胞×400

图2 前肠椭圆形的5-羟色胺细胞×400

图3 前肠中有长胞突伸向消化腔的长梭形的5-羟色胺细胞×400

图4 中肠中椭圆形5-羟色胺细胞×400

图5 中肠中楔形5-羟色胺细胞×400

图6 胃贲门中长胞突伸入消化腔的梭形5-HT-IR细胞×400

图7 胃体中梭形的5-HT-IR细胞×400

图8 胃体部腺泡上皮中椭圆形的5-HT-IR细胞×400

图9 幽门部腺泡上皮中楔形的5-HT-IR细胞×400

图10 胃幽门部圆形五羟色胺细胞×400

图11 胃贲中梭形的SS-IR细胞×400

图12 胃体中椭圆形SS-IR细胞×400

图13 中肠中椭圆形的Gas-IR细胞×400

图14 前肠中椭圆形的Gas-IR细胞×400

图15 后肠中不规则的Gas-IR细胞×400

Ep：上皮；L：消化道腔；LP：固有膜；SG：胃腺

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Round 5-HT immunoreactive cells in the oesophagus×400

Fig.2 oval 5-HT immunoreactive cells in the foregut.×400

Fig.3 long shuttle shape 5-HT immunoreactive cells in the foregut，the long cytoplasmic process extending to its lumen of the digestive tract×400

Fig.4 oval 5-HT immunoreactive cells in the midgut.×400

Fig.5 The wedge-shaped 5-HT immunoreactive cells in the midgut×400

Fig.6 shuttle shape5-HT immunoreactive cells in the stomachus cardiacus，the long cytoplasmic process extending to its lumen of the digestive tract×400

Fig.7 oval 5-HT immunoreactive cells in the stomachus corpus×400

Fig.8 oval 5-HT immunoreactive cells in the epithelial acinar of stomachus corpus×400

Fig.9 The wedge-shaped 5-HT immunoreactive cells in the epithelial acinar of stomachus pyloricus×400

Fig.1 0 round 5-HT immunoreactive cells in the stomachus pyloricus×400

Fig.1 1 shuttle shape SS immunoreactive cells in the stomachus cardiacus×400

Fig.1 2 oval SS immunoreactive cells in the stomachus corpus×400

Fig.1 3 oval Gas immunoreactive cells in the midgut×400

Fig.1 4 oval Gas immunoreactive cells in the foregut×400

Fig.1 5 irregular Gas immunoreactive cells in the hindgut×400

Ep：epithelium；L：the lumen of the digestive tract；LP：lamina porpria；SG：stomach gland

Comparative Immunohistodhemical Study of Six Kinds of Endocrine Cells in the Digestive Tract of Two Species of Stomach-containing Teleosts

Jin Xianwen1，Huang Shan2，Wu Xiaobing3＊
（1College of Life Science，Huaibei Normal University；2College of Physical Education，Huaibei Normal University，Anhui 235000；3College of Life Science，Auhui Normal University，Wuhu 241000，China）

ObjectiveComparative study immunohistochemical staining of endocrine cells in the gastrointestinal tract of Clarias fuscas and Pelteobagrus vachelli were studied with six gut hormone antisera.MethodsThe streptavidin biotin-peroxidase complex （SABC） method was used.ResultsThe 5-hydroxytryptamine immunoreactive cells were distributed throughout the digestive tract except the hindgut of the Clarias fuscas.The distribution density was the highest in the cardiacus or pyloricus，Then the foredgut and hindgut，and the lowest in the oesophagus.The somatostatin immunoreactive cells were distributed only in the stomachus cardiacus and the body of stomach，but not in the oesophagus，stomachus pyloricus and intestine of Clarias fuscas.But the SS-IR cells were distributed only in the oesophagus and the stomach of Pelteobagrus vachelli.The Gas-IR cells were observed only in the intestine of Clarias fuscas and stomachus pyloricus and foregut of Pelteobagrus vachelli.The PP-IR cells were observed only in the stomachus pyloricus and foregut of Pelteobagrus vachelli.The SP-IR and Glu-IR cells were not found in the digestive tract of two species of stomach-containing teleosts.ConclusionComparing with two species of stomach-containing teleosts，we found some common features in the distribution of 6kinds of endocrine cells in the gastrointestinal tract，which reflect their similarity in digestive physiology.However，the difference is also significant，Which may be related to their feed habit and habitation.

Clarias fuscas；Pelteobagrus vachelli Richardson；Digestive tract；Endocrine cells；Immunohistochemistry

Q954

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.019

2011-08-15

2011-10-10

金显文，男（1970年），汉族，副教授。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）