红芪多糖影响实验性脾虚大鼠胃黏膜中p53基因蛋白表达的实验研究*

万生芳，张本忠

(1．甘肃中医学院，甘肃兰州 730000;2．兰州大学公共卫生学院，甘肃 兰州 730000)

红芪是豆科植物多序岩黄芪(Hedysarum Polybotrys Hand．-Mazz)的干燥根，主产甘肃，效同黄芪。临床常将红芪代替黄芪使用［1］。现代研究［2］证实，红芪中含有多种生物活性物质，且含有黄芪中不存在的抗菌成分1-3-羟基-9甲氧基紫檀烷等［3］，且有镇痛、抗炎、耐缺氧、免疫调节等作用［4-6］。本研究观察了红芪多糖影响胃黏膜病变相关因子表达状况，以探讨红芪多糖在防治胃黏膜病变方面的分子机制。

1 材料与方法

1．1 动物

Wistar大鼠，SPF级，雄性，鼠龄 80～100 d，体质量(200±10)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，合格证号为SCXK(甘)2011-0001。

1．2 药品、试剂与仪器

红芪，选用甘肃宕昌GAP种植基地产红芪，经甘肃中医学院生药学教研室鉴定为豆科岩黄芪属植物多序黄芪(Hedysarum polybotrys．hand．-Mazz)的干燥根茎，等级优;大黄，选用甘肃陇南地区GAP种植基地产大黄，经甘肃中医学院生药学教研室鉴定为掌叶大黄(Rheum palmatum)的根，等级优。鼠抗人p53单克隆抗体，研域上海化学试剂有限公司提供，批号RC1430;SABC-FITC(大鼠IgG)试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司提供，批号 SA1069;黄芪多糖，北京美迪克斯生物科技有限公司提供，批号HD006001。BX51/BX52型 Olympus系统显微镜，产地日本;LEICACM1900型恒冷箱切片机，产地德国;免疫组化载玻片，Poly-L-Lysine材质，武汉博士德生物工程有限公司提供。

1．3 药品的制备

红芪多糖的制备：将1 000 g红芪饮片加入5 000 mL水，浸泡1 h;煎煮30 min，趁热抽滤;再加入5 000 mL水2次煎煮30 min，趁热抽滤;2次药液混合，冷却后加无水乙醇至含醇量600 g/L，静置24 h;抽滤，滤液用无水乙醇和乙醚依次冲洗沉淀，沉淀物即为红芪多糖;60℃烘干备用。

制备1000 g/L大黄水煎液：大黄饮片500 g，加入2 500 mL水，浸泡1 h;煎煮30 min，滤渣;2次煎煮;2次药液混合，明火沸腾至药液量达800 mL;将药液置于60℃水浴锅内，浓缩至500 mL，即为1 000 g/L大黄水煎液(每mL含生药1g)。

1．4 动物分组与脾虚证模型的建立

将60只大鼠随机分空白对照组，模型对照组，黄芪多糖高、中剂量组及红芪多糖高、中剂量组。每组10只。空白对照组大鼠不予特殊处理，正常饲养;其余5组参照文献［7-9］制备脾虚证模型。用1 000 g/L大黄水煎液75 μL/g体质量，每天灌胃，1 d 2次，连续42 d。密切观察大鼠一般情况。若有食欲不振(食量减少)、消瘦(体质量下降)、大便稀溏、肛门污秽、倦怠乏力(悬空拉尾抵抗力减弱)、毛发不荣、萎靡嗜睡、眯眼等症状，则提示造大鼠脾虚模成功。

1．5 用药方法

参照实验动物学［10］人与大鼠体表面积比计算给药剂量。黄芪多糖人常规用量为50 mg/60 kg体质量，则大鼠中剂量组合理给药量为0．025 mg/g体质量，高剂量组给药量为0．05 mg/g体质量。加蒸馏水将黄芪多糖分别配制为10 g/L、5 g/L的溶液，按高、中剂量在造模后第2天开始对黄芪多糖高、中剂量组大鼠分别进行灌胃，每天0．005 mL/g体质量，连续灌胃30 d;加蒸馏水将红芪多糖分别配制为10 g/L、5 g/L的溶液，按高、中剂量在造模后第2天开始对红芪多糖组大鼠分别进行灌胃，每天5 μL/g体质量，连续灌胃30 d。

1．6 检测指标

造模后第2天，处死空白对照及模型对照组大鼠，取大鼠胃标本按试剂盒说明进行免疫组化染色;各药物组于用药第31天，断颈处死所有大鼠;取大鼠胃，沿胃大弯剪开;将标本放入100 g/L甲醛固定液中;固定后以石蜡包埋，连续切片(厚 度4 μm);经冷丙酮固定;PBS冲洗后加入体积分数10%的封闭用正常兔血清，置室温3 h;加兔抗大鼠p53多抗，体积为1∶50;DAB显色液进行显色，光镜观察。阴性对照者用PBS代替一抗。所有标本一次测定。

用已知的阳性组织切片做阳性对照，用PBS作阴性对照，用DAB染色，p53细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性。读片时每张切片分别取上、下、左、右及中心共5个区域的细胞计数，每个区计数100个黏膜细胞，共计数500个，计算阳性细胞所占比例。

1．7 统计学方法

采用SPSS 16．0统计分析软件处理。组间百分率的比较采用Pearson卡方检验。以P＜0．05为差别有统计学意义。

2 结果

模型对照组p53阳性表达率较空白对照组高，差别有统计学意义(P＜0．01);红芪多糖高、中剂量组，黄芪多糖高剂量组p53阳性表达率较模型对照组降低，差别有统计学意义(P＜0．01);黄芪多糖高、中剂量组之间p53阳性表达率存在显著差异(P＜0．01)，红芪多糖高、中剂量组之间p53阳性表达率无差异(P＞0．05)。见表1。

表1 各组p53阳性表达率对比

3 讨论

p53基因是目前研究最广泛和深入的一种抑癌基因。野生型p53在细胞损伤修复过程中能监视基因组DNA的完整性，修复DNA的损伤，还能启动细胞的凋亡过程，引导具有癌变倾向的突变细胞进入程序性死亡。突变型p53则具有致癌作用［11］。p53基因突变常导致其抑制癌作用的丧失，还可能促进细胞的恶性转化。p53的高表达与癌关系密切，因此若胃黏膜病变中p53阳性表达，临床就必须高度警惕。吴苏冬等［12］研究表明，脾虚大鼠胃黏膜的损伤指数明显高于正常对照组。也有学者提出，脾虚是胃癌发生、发展的一种机体内部的基础和条件。刘晓颖等［13］研究发现，脾虚证慢性萎缩性胃炎的相关癌基因p53表达异常。本实验结果表明，模型对照组p53的阳性表达显著高于空白对照组，说明脾虚证大鼠胃黏膜的损伤指数较高，如果脾虚证不加以治疗，有可能发展为胃黏膜癌前病变。

红芪作为传统中药材，其主要功效是补气固表，敛疮生肌，现广泛应用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、久泻脱肛、便血崩漏、表虚自汗等。本实验结果表明，红芪多糖降低了脾虚证大鼠胃黏膜p53表达率与含量，提示红芪多糖对脾虚证胃黏膜组织中p53的表达有一定抑制作用，通过减少p53基因的表达，从而增加了胃黏膜细胞凋亡，进而阻止脾虚证大鼠胃黏膜进一步发生病变。

此外，本实验中红芪多糖和黄芪多糖的作用没有显著差异，提示我们在临床实际工作中，可以用红芪来代替黄芪。今后，本课题组将继续对红芪进行更深入的研究，为甘肃的道地中药材红芪产品的研发提供依据。

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