针刺对哮喘大鼠肺与大肠SP-A mRNA表达的影响*

严兴科，张 燕，于 璐，陈 程，崔海福，杨 波

(1．甘肃中医学院针灸推拿系，甘肃 兰州 730000;2．长春中医药大学针灸推拿学院，吉林长春 130117)

肺与大肠表里相合，是中医脏腑表里相关理论的组成部分之一。肺与大肠在生理上相互联系，病理上相互影响。有资料［1］表明，二者的密切联系具有生物医学依据。以往认为肺表面活性蛋白(surfactant protein，SP)只在肺内存在［2］，且有 A、B、C、D 4种亚型，其中以SP-A含量最为丰富，是降低肺泡表面张力，维持肺泡稳定和正常的呼吸功能的重要物质。近来发现，在结肠和小肠表面也有SP-A基因存在和蛋白表达［3］，表明肠道表面和肺表面存在密切联系。本实验从针灸治疗哮喘为切入点，观察了哮喘大鼠肺与大肠SP-A mRNA表达改变及针刺对其的调节，为脏腑相关的物质基础研究和针灸效应研究提供依据。

1 材料与动物

1．1 动 物

雄性Sprague-Dawley大鼠，清洁级，体质量(130±30)g，由吉林大学实验动物中心提供，动物质量合格证号为20080020。

1．2 试剂与仪器

卵蛋白，OVA，美国Sigma公司进口分装，批号20080321;氢氧化铝，长春新华宇生物科技有限公司，批号20080626;戊巴比妥钠，美国Sigma公司进口分装，批号200901111;TRIzol，美国 Invitrogen公司产品;氯仿，北京市化工厂产品，批号20090121;DEPC原液，Sigma公司进口分装;琼脂糖，西班牙Biowest公司产品;RT-PCR一步法试剂盒，美国Promega公司产品;DNA Marker，北京天根生化科技有限公司产品;引物序列，宝生物工程大连有限公司产品。SMUP-B型生物信号处理系统，上海嘉龙教学仪器厂产品;呼吸流量测定系统，美国Kent Scientific Corporation产品;呼吸流量实验测量软件，复旦大学医学院生理教研室提供;Allegra X-22R低温高速离心机，德国Beckman Coulter公司产品;5418小型高速离心机，Eppendorf公司产品;TC-512 PCR扩增仪，英国Techne公司产品;Cintra 202型紫外分光光度计，澳大利亚GBC公司产品;DYY-12C型水平电泳系统，北京六一仪器厂产品;Power Pac HV电泳仪，美国Bio-Rad公司产品;TANNON-2010数码凝胶图像分析系统及GIS凝胶图像分析软件，上海天能科技有限公司产品;Milli-DI超纯水系统，美国Millipore公司产品。

1．3 分组与模型的建立

将48只SD大鼠随机分成空白对照组、捆绑组、假手术组、哮喘模型组、原络配穴组(太渊、偏历)、原穴组(太渊)6组。

哮喘模型组的处理参照文献方法［4］：将SD大鼠在实验第1天一次性向腹腔注射含卵蛋白0．250 g和氢氧化铝凝胶0．250 g的生理盐水1．5 mL以致敏，第15天将大鼠用5 g/L戊巴比妥钠麻醉后固定于手术台上，行气管插管术，并于颈外静脉内注射卵蛋白(0．250 g/kg体质量)激发哮喘发作。原络配穴组大鼠、原穴组大鼠第1天致敏，腹腔注射后1 h进行针刺治疗，于实验第15天激发哮喘发作，方法同上。假手术组大鼠于第1天腹腔注射1．5 mL生理盐水，第15天以等量生理盐水(1 μL/g)行颈外静脉注射，方法同上。空白对照组大鼠不做任何处理，正常饲养。

1．4 穴位选取与针刺

穴位定位据《实验针灸学》［5］确定。针刺方法：平补平泻，每次留针20 min，每隔5 min行针1次，隔日针刺1次，共针7次。

原络配穴组自实验第1天开始进行针刺治疗，穴位选取太渊(双)、偏历(双);原穴组穴位选取太渊(双);捆绑组自实验第1天起开始捆绑，不针刺，每次20 min，隔日绑1次，共捆绑7次。

1．5 检测指标与方法

1．5．1 各组大鼠总RNA样品的制备

大鼠放血处死后，迅速在冰盘上切取肺、大肠组织。组织选取部位：肺组织——取左肺下叶肺尖(1 cm×1 cm);大肠组织——自阑门向大肠方向2．5 cm处取1 cm肠段。组织切取后用锡纸包好，迅速做好标记放入液氮中冷冻，使液氮渗透到组织内部而防止组织内部发生RNA降解，后移至-80℃超低温冰箱中保存。

用TRIzol法抽提组织中的总RNA，所得总RNA经紫外分管光度计检测纯度及浓度。用紫外分光光度计检测波长260 nm和280 nm的吸光度值，D260/D280的比值在1．8～2．0之间的予以保留，其余弃去不用。总 RNA原液稀释一定比例，使样品总RNA溶液的D260值在0．1～0．4之间，放入通光池中检测，利用公式计算总RNA的浓度。根据所测RNA浓度调整PCR体系中总RNA的体积，使各体系所含的RNA量相同。

1．5．2 肺与大肠SP-A mRNA表达水平

引物序列设计按照参考文献［6］，引物序列由宝生物工程(大连)公司合成。SP-A：5’-GGAAGCCCTGGGATCCCTGGA-3’(上游)，5’-TGGGTACCAGTTGGTGTAGT-3’(下游);GAPDH：5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG3’(上游)，5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’(下游)。以SP-A为目的基因，以GAPDH为内参，在同一体系内做RT-PCR基因扩增，进行琼脂糖凝胶电泳，将同一泳道内的SP-A与GAPDH两条基因表达条带的相对密度比作为SP-A mRNA表达水平的反映。

一步法RT-PCR反应程序：45℃逆转录45 min，94℃预变性 2 min，94℃变性 30 s，60℃退火1 min，延伸 68℃ 2 min，循环 40次，68℃延伸7 min，最后降至4℃结束反应。基因扩增结束后，取3 mL RT-PCR产物在经EB染色的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压60 V，时间为100 min。

各组RNA样品按一步法程序经RT-PCR基因扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束将凝胶移至GIS数码凝胶图像分析系统中拍照。

1．6 统计学方法

采用SPSS 11．0统计分析软件处理。计量资料数据以均数()±标准差(s)表示，多组间比较和组间两两比较用单因素方差分析。以P＜0．05为差别有统计学意义。

2 结果

肺和大肠组织中均有SP-A mRNA表达。各组中肺和大肠SP-A mRNA的表达水平由SP-A和GAPDH 2条条带的相对密度比代表。见图1及表1，2。

图1 各组大鼠肺与大肠组织SP-A mRNA表达

表1 肺组织中SP-A mRNA表达水平 ±s

表1 肺组织中SP-A mRNA表达水平 ±s

注：与空白对照组对比，＊＊P ＜0．05;与假手术组对比，###P ＜0．01;与哮喘模型组对比，△△ P＜0．05，△△△P＜0．01;与原穴组对比，＊＊P ＜0．05。

组 别 动物数 SP-A，GAPDH 相对密度比空白对照组81．204 ±0．028捆绑组 8 1．458 ±0．095＊＊假手术组 8 1．538 ±0．202＊＊哮喘模型组 8 0．920 ±0．092###原络配穴组 8 1．215 ±0．211△△△＊＊原穴组 8 1．102 ±0．199△△

表2 大肠组织中SP-A mRNA表达水平 ±s

表2 大肠组织中SP-A mRNA表达水平 ±s

注：与空白对照组对比，＊＊P＜0．05;与假手术组对比，##P＜0．05;与哮喘模型组比较，△△P＜0．05;与原穴组对比，＊P＞0．05。

组 别 动物数 SP-A，GAPDH 相对密度比空白对照组81．592 ±0．082捆绑组 8 1．760 ±0．056＊＊#假手术组 8 1．210 ±0．103＊＊哮喘模型组 8 0．872 ±0．060##原络配穴组 8 1．071 ±0．062△△＊原穴组 8 1．233 ±0．047△△

图1可见，肺和大肠组织中均扩增出目的基因SP-A和内参GAPDH基因，且各组间SP-A基因的表达丰度存在差异。由表1可知，哮喘模型组大鼠肺组织SP-A mRNA表达水平与假手术组对比明显降低，差别有统计学意义(P＜0．01);捆绑组、假手术组与空白对照组对比，肺组织SP-A mRNA的表达水平升高，差别有统计学意义(P＜0．05)，提示捆绑束缚刺激、手术伤害性损伤等因素对大鼠肺SP-A mRNA表达有显著影响;原络配穴组和原穴组大鼠肺组织SPA mRN表达水平与哮喘模型组对比明显升高，差别有统计学意义(P ＜0．01，P ＜0．05)，且原络配穴组大鼠肺组织SP-A mRNA表达水平高于原穴组，差别有统计学意义(P＜0．05)。提示针刺能够明显升高哮喘大鼠肺组织中SP-A mRNA表达水平，原络配穴法效果优于单纯原穴法治疗。

由表2可知，捆绑组、假手术组大肠组织SP-A mRNA表达水平与空白对照组对比，假手术组与捆绑组对比，差别均有统计学意义(P＜0．05)，提示手术伤害性损伤对大鼠大肠SP-A mRNA表达有明显影响，手术伤害性损伤与捆绑是2种不同性质的刺激;原络配穴组、原穴组大鼠大肠组织SP-A mRNA表达水平与哮喘模型组对比，差别均有统计学意义(P＜0．05)，而此2组间差别无统计学意义(P＞0．05)，但以原络配穴组升高幅度较大，提示针刺治疗能够显著升高哮喘大鼠大肠组织SP-A mRNA的表达水平，且以原络配穴法效果较优。

3 讨论

整体观念是中医学的基本特征之一，脏腑相关是其理论核心，认为人体内部的组织器官是相互联系的统一整体［7］，并在中医临床实践中发挥着至关重要的指导作用。中医学关于肺和大肠关系的认识源于《黄帝内经》，《灵枢·本输》篇称这种关系为“肺合大肠”，《素问·血气形志》篇称之为“阳明与太阴为表里”。肺与大肠通过经络相联系，构成脏腑阴阳表里的络属关系，构成肺与大肠在生理、病理、治疗上的相互关系。肺与大肠的上述有机联系，是中医学以藏象学说为核心的整体观念的一种体现。

SP-A是肺表面活性物质的重要蛋白成分，在肺泡中的功能是促进PS在气液界面的吸附和扩展，协助表面活性物质磷脂降低表面张力，调节磷脂的合成、分泌和再循环。SP-A能够维持PS正常的结构和代谢，表现为SP-A作为自身调节因子可稳定细胞内外的表面活性物质水平［8］。因此，SP-A在肺中的作用之一是保证PS发挥其正常的生理功能，维持正常的呼吸运动。PS量的减少和SP-A、SP-B等的基因改变与呼吸系统疾病密切相关。有学者［9］测定了哮喘患者与正常人肺泡灌洗液中SP-A蛋白的含量，发现哮喘患者肺泡灌洗液中SP-A含量明显下降(P＜0．05)，而磷脂酰胆碱含量基本一致。

SP-A有调节炎性及过敏反应的作用，在肺的免疫系统防御功能中有重要作用［10］。以往认为，SP-A只在肺内存在，且含量最为丰富，是降低肺泡表面张力、维持肺泡稳定和正常的呼吸功能的重要物质。近来发现，在结肠和小肠表面也发现有SP-A基因和蛋白表达存在［3］，表明肠道表面和肺表面存在密切联系。

本次研究结果也显示，哮喘模型组大鼠肺及大肠组织中SP-A mRNA的表达水平低于假手术组大鼠，而针刺相应腧穴又可使肺和大肠组织中SP-A mRNA表达显著增加，提示SP-A基因和蛋白表达可能是肺和大肠相关的重要物质基础和途径。有资料［11］表明，结肠和肺中SP-A基因序列完全相同，且这两种器官中编码SP-A的基因转录子起始于相同的位点，此为本实验结果提供了依据。本实验中，哮喘发作时SP-A mRNA表达减少，针刺后SP-A mRNA表达增加，说明肺与大肠组织SP-A mRNA的表达减少或增加均与哮喘发病有关，SP-A可能是肺和大肠之间相互联系的物质基础和途径。同时实验结果还显示针刺提高了哮喘大鼠肺和大肠组织中SP-A mRNA的表达水平，且原络配穴组针刺效果优于单纯原穴针刺组，提示针刺参与调节哮喘大鼠肺和大肠组织SP-A mRNA的表达水平，并且强调了表里两经的联系和协同作用，而肺和大肠组织中SP-A存在的联系机制和具体作用途径还有待于今后更深入地研究。

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