视网膜色素变性治疗最新进展△

陈 娟 马晓晔

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一种眼科常见的遗传性疾病。患者早期表现为“夜盲”，进而表现为周边视野缺损，最终导致中心视力丧失。该病目前尚无有效的预防和治愈方法。近年来，随着基因治疗、视网膜移植等技术在动物实验中的广泛开展，给人类RP的治疗带来了新的希望。本文就当前RP的各种最新治疗进展综述如下。

1 基因治疗

1.1 RP基因 RP具有多种遗传方式，其中常染色体显性遗传RP(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)占15% ～20%，常染色体隐性遗传RP(autosomal recessive retinitis pigmentosa，ARRP)占20% ～25%，X染色体连锁遗传 RP(X-linked retinitis pigmentosa，XLRP)占10% ～15%，散发型 RP占40% ～45%［1］。目前已有超过60种ADRP基因、20种ARRP基因及5种XLRP基因被定位;其中引起ADRP的视紫红质基因的突变位点超过150个［2］。与隐性RP相关的位点有20个，其中14个基因被克隆，多数基因较为少见。XLRP患者无论从发病时间还是预后角度讲均最为严重，已知有5个位点与XLRP有关，其中有2个基因已被克隆，这2个基因的蛋白产物在多种组织中表达，但蛋白质的确切功能还不清楚。不断发现的与RP相关的基因和位点以及基因突变位点的差异表明，导致RP的分子发病机制非常复杂。基因的广泛深入研究为基因治疗提供了坚实的基础。

1.2 基因治疗途径 主要分体内和体外两种。体内基因治疗主要用合适的载体携带目的基因经视网膜下腔注射或玻璃体腔注射进行治疗。所用的载体主要分为病毒载体和非病毒载体。体外基因治疗主要是把转基因靶细胞移植到眼内，使外源性基因表达与视网膜移植手术联合使用以达到基因治疗的目的。

1.3 基因增补 ARRP主要是由于基因突变、基因产物缺乏引起的。对于这种类型的RP，可以通过基因增补技术把正常基因导入感光细胞内，以产生正常的基因表型，达到治疗的目的。RPE65基因特别表达于视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)，并且在11-顺-视黄醛、视杆细胞和视锥细胞视蛋白色基的再循环中起着重要作用。Mao等［3］将野生型人RHO基因导入RHO-/-小鼠后，视网膜电图表明接受基因治疗的小鼠在治疗后6个月，A波振幅增加了79%，治疗眼外核层厚度与对照眼相比增加了80%。这些结果表明，野生型RHO基因具有抑制突变蛋白的功能。Acland等［4］将RPE65基因导入4月龄的RPE65-/-狗，95 d后b波的阈值下降4个对数单位，接近于正常;振幅为正常的16%左右，感光细胞的振幅也为正常的16%，但对照组基本消失。Bemelmans等［5］将慢病毒介导的RPE65基因注射到RPE65-/-小鼠视网膜下腔内，可以使RPE65基因在RPE持续表达，视网膜电图记录到的图像与正常类似。RPE65基因转移后至少4个月内可以防止视锥细胞的退化，而对照组小鼠的视锥细胞则完全退化。Sarra等［6］发现将正常RHO基因导入视网膜退化突变小鼠感光细胞后，可使感光细胞的酶活性和细胞功能恢复正常，且病毒滴度的增加可以提高转导效率和感光细胞转导起始速度。

1.4 基因沉默 目前研究认为，ADRP的发病机制是由于感光细胞中出现异常基因产物堆积，最后导致细胞坏死。正常基因的导入并不能达到根本的治疗目的，可行的方法是通过基因沉默使突变基因不表达或者少表达蛋白产物。

1.4.1 锤头状核酶 锤头状核酶是一种小型催化性RNA，具有催化裂解其他顺式或反式RNA的功能，可识别特异性片段并产生裂解以催化清除异常基因。目前锤头状核酶已应用于获得性免疫缺陷综合征、帕金森病、血友病及RP等基因治疗。Sullivan等［7］的体外研究证实锤头状核酶可以有效治疗ADRP。Fritz等［8］设计了一套针对人类P23H视杆蛋白基因的锤头状核酶。A1i等［9］认为锤头状核酶通过体内基因转移，能使RPE细胞复杂的超微结构缺陷在形态和功能上得到矫正。Gorbatyuk等［10］使用设计的锤头状核酶Rz397体外转染HEK293细胞与野生型RHO基因，结果发现转染后1 d导致RHO mRNA表达下降60%;将AAV2-Rz397从视网膜下腔注入P6小鼠后发现，锤头状核酶可以显著降低(≥50%)RHO基因在P6小鼠视网膜中的表达。Shaw等［11］将锤头状核酶导入P347L猪眼后证实锤头状核酶能靶向破坏P347L序列，从而发挥保护感光细胞的作用。

1.4.2 RNA 干扰 RNA 干扰(RNA interference，RNAi)现象广泛存在于动植物的细胞中，是机体为适应环境变化而在蛋白翻译水平进行调控的重要机制。与目的基因序列同源的双链小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)进入细胞后导致的基因转录后沉默现象称为RNAi。RNAi近几年来成为眼科治疗ADRP的新研究方向。Georgiadis等［12］使用重组腺病毒转录的针对外周蛋白-2(Prph2)基因的siRNA研究小鼠视网膜上Prph2基因表达情况，发现短发夹结构的siRNA可以有效且特异地使Prph2基因沉默，在小鼠活体经视网膜下腔注射后3周开始抑制Prph2基因的表达。Chadderton等［13］最近利用RNAi技术在ADRP小鼠模型视网膜下腔注射携带针对突变RHO siRNA的重组腺病毒载体，同时联合移植鼠源性野生型RHO基因，利用视网膜电图评估疗效，结果表明突变点RNAi联合RHO基因移植可以有效治疗RHO基因突变引起的ADRP。O’Reilly等［14］同样利用RNAi技术联合野生型RHO基因转入小鼠活体实验和细胞实验均证实针对突变RHO基因的siRNA能抑制90%突变型RHO基因的表达，同时导入的野生型RHO基因能够正常表达。

1.5 凋亡抑制 Bcl-2家族是研究及应用最广泛的一种抑制凋亡的基因，Bcl-2的表达具有保护光感受器细胞的作用，然而其过度表达也可导致大鼠光感受器细胞死亡，其原因尚不清楚，可能是Bcl-2基因的过度表达破坏了Bcl-2/Bax的平衡。Bcl-2也能抑制γ-PDE基因突变引起感光细胞的凋亡［15］。Yoshizawa等［16］研究发现，由甲基亚硝基脲诱导的小鼠RP是可以高度再生的，机制主要与Bcl-2蛋白减少、Bax蛋白增加等有关。Murakami等［17］证实细胞凋亡诱导因子途径在神经保护作用中有着重要的地位，该研究表明细胞凋亡诱导因子可以上调Bcl-2表达，最终导致感光细胞的凋亡。

2 干细胞移植

诱导多能干细胞是一项创新技术，可以作为一个无限细胞分化或组织工程来源。最近研究发现，诱导多能干细胞具有治疗 RP等疾病的潜力［18］。Smith等［19］将自体同源骨髓衍生的家族阴性的造血干细胞注入大鼠的退行性静脉中，可以在一定程度上防治视锥细胞的死亡，保护中心椎体视觉且没有明显的排异反应。Idelson等［20］利用特定的培养方法，使具有多能分化潜力的人类胚胎干细胞成功培养分化出功能形态学上都正常的RPE细胞。为将来治疗因RPE细胞异常机能障碍引起的RP提供依据。Wang等［21］在一项非侵袭性干细胞治疗的研究中发现，在RP大鼠模型的感光细胞还没有大量丧失之前，在大鼠尾静脉注射干细胞进行治疗，当未治疗的大鼠感光细胞只有1～2层时，经过干细胞注射治疗，大鼠感光细胞增加至5～6层。

3 视网膜移植

RP是由于感光细胞凋亡，最终导致感光细胞功能的丧失［22］。因此RPE移植研究思路即是将RPE细胞经体外培养后，注入视网膜下腔或将含RPE细胞和感光细胞片的视网膜用手术的方法直接植入受体视网膜下腔，用来补充或修复凋亡的RPE细胞和感光细胞，以达到治疗目的。视网膜移植的方法主要分为细胞移植和组织场面移植。

3.1 细胞移植 可进行移植的细胞包括感光细胞、RPE细胞、神经干细胞和雪旺细胞等。通常所说的视网膜细胞移植是指感光细胞和RPE细胞移植。Gouras等［23］将正常小鼠中分离的RPE细胞移植到RPE65-/-变性小鼠的视网膜下腔，对照组注射生理盐水。结果发现移植后RPE65-/-小鼠外核层厚度较对照组明显增厚，同时3.7周后小鼠视网膜电图显示振幅明显增大，提示RPE移植是治疗RP的有效方法之一。Sauve等［24］在RP大鼠的视网膜下腔注射人类衍生RPE细胞株ARPE-19，可以部分保留视杆细胞和视锥细胞的视网膜电图功能。Gouras等［25］首先报道酶解Bruch膜RPE移植术，他们将人RPE细胞经处理后直接注射于猴的Bruch膜，术后2 h内，移植的RPE细胞可与宿主Bruch膜黏合，形成一层类上皮样细胞层，病理检查发现被移植的RPE细胞形态及功能均正常，说明这一方法的可行性。

3.2 视网膜组织块移植 Yang等［26］将正常的大鼠光感受器及视网膜移植到3个月大的P23H大鼠(Pro-23-His视紫红质大鼠)，6个月后评估视功能和视锥细胞计数。研究发现移植后的视锥细胞损伤减少了10%，同时视网膜电图发现b波振幅增加了78%。Woch等［27］将新生鼠的视网膜片植入37～69 d RP大鼠的视网膜下腔，移植63 d～10个月后，大鼠上丘脑刺激实验证实植入的视网膜片具有应答反应。Arai等［28］将完整的视网膜片移植入RP大鼠视网膜后，可以记录到上丘对闪光的视反应。

4 神经营养因子

神经营养因子是一类对神经系统分化、发育、神经元存活、轴突再生有着重要作用的细胞因子。相关研究已经证实眼组织中存在着神经营养因子，包括睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、碱性成纤维细胞生长因子、晶状体上皮源性生长因子、肝细胞源性生长因子、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等，且许多已应用于治疗各种神经退行性疾病［29］。研究表明各种神经营养因子通过玻璃体腔及视网膜下腔注射可以有效挽救RP动物模型的感光细胞，神经营养因子多与基因治疗相结合。CNTF已经被证实具有视网膜保护作用，且不会引起视网膜下胶质细胞增生［30］。Rhee等［31］将 rAAV 介导的 CNTF 注射到 RP小鼠视网膜下腔，发现可以维持感光内视紫红质的表达。Azadi等［32］将CNTF联合BDNF移植治疗RP小鼠，发现治疗后小鼠TUNEL染色阳性的光感受器细胞数量较对照组明显下降，同时体内可以检测到内源性CNTF表达显著增高，证明CNTF联合BDNF治疗有确定的神经保护作用。Zhang等［33］将BDNF质粒注入RCS大鼠视网膜下腔或者玻璃体腔后再行电穿孔术治疗RP，发现治疗组和对照组视网膜光感受器细胞凋亡率有明显的差异，证明BDNF移植是治疗RP的有效方法之一。

5 人工视力

人工视力主要包括视盘植入微电极、视网膜下腔植入人工视网膜硅芯片以及电针疗法。Sakaguchi等［34］研究表明，将3个微电极植入已经失明的RP患者的左眼视盘，6个月后，通过电刺激患者可以出现视觉反应。通过刺激不同的电极患者产生视觉的部位及能感知的形状也有所不同。在随后的随访中没有发现任何并发症，提示通过植入电极可以有效地修复视觉缺损。Chow等［35］研究表明，将人工视网膜硅芯片植入6位患者的右眼，在随后的6～18个月随访中，芯片依靠自带的电量发挥一定的功能，没有移植排异等反应，所有患者的视觉都得到一定的改善。

6 其他

Tam等［36］研究表明RHO基因突变引起的RP存在光依赖性。它们在RHO突变基因的小鼠动物模型中进行绿光照射刺激，发现可以诱发其感光细胞的变性，因此临床上应给予配戴墨镜等处理以减少光源对眼视网膜的损伤。另外，还可以通过我国传统医学的针灸、中药等联合治疗改善视网膜微循环，进而缓解感光细胞的凋亡。

7 总结

基因治疗将成为RP治疗的主要方法，RP基因治疗已经通过了最初的实验阶段，但在基因治疗过程中，其有效性、给药途径、载体的安全性等问题还有待于广大眼科工作者进行深入地研究。希望这些新技术、新疗法能尽早实现治疗RP的目标，相信在不久的将来，这些新疗法能够安全有效地治疗RP，为RP患者带来福音。

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