MicroRNA及其在糖尿病视网膜病变中的研究进展△

张 俊 周琦 吕红彬

目前，糖尿病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病之后影响全球性公共健康的第三大慢性非传染性疾病。在发达国家，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是成年人致盲的首位原因。MicroRNA(miRNA)是一类长度为21～25个核苷酸的单链非编码RNA分子，其通过与靶基因序列特异性相互作用，在转录后水平调节mRNA的表达。miRNA在线虫、果蝇、哺乳动物、植物，甚至病毒中广泛存在，其基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区，其转录独立于其他基因，且在进化过程中保持高度保守。miRNA在表达上具有组织和时间的特异性，在生物体的各种生命活动过程中发挥着重要作用。近年来，miRNA与糖尿病，尤其是DR的发生和发展的关系已成为研究热点。本文主要就miRNA及其在DR中的研究进展做一综述。

1 miRNA的发现

1998年美国科学家Fire和Mello发现dsRNA能诱导基因沉默，并因此荣获2006年诺贝尔医学奖。而早在1993年，Lee等［1］就已报道了第一个可定时调控胚胎后期发育的小分子RNA:lin-4。2000年Reinhart等［2］发现了另一个类似的具有转录后调节功能的小分子RNA:let-7。2001年Science报道了研究者从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似lin-4的小分子RNA基因，被命名为microRNA，即miRNA。2002年，miRNA的发现被美国著名杂志Science评为10大科技突破的第1名。

迄今为止，已经在人类、果蝇、植物、细菌、病毒等多个生物物种中发现数千种miRNA。其中，仅miRBase 18.0中就收录发夹前体序列18 226条，成熟miRNA 21 463条，共涵盖168个物种。研究人员预测人类有超过30%蛋白编码基因受到miRNA的调控。

2 miRNA的生物合成和作用机制

miRNA的表达受严格的调控，大多数基因位于染色体内含子、基因间区域或不编码mRNA的外显子，在自己的启动子和调节序列控制下表达，另外一些miRNA在基因组中有多个位点，它们受到共同的调控并以多顺反子的形式转录。但是不论其来自何处，其加工成熟机制都是相同的。miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II(pol II)转录的，最初产物为大的具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的具有茎-环的 miRNA基因转录体(pri-miRNA)。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成一个长度为60～70个核苷酸组成的具有特征茎-环结构的前体miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)。然后 Ran-GTP和 Exportin-5共同作用将pre-miRNA输送到细胞质中。随后，另一个核酸酶Dicer将其剪切为约22 bp的二聚体RNA，这个二聚体RNA是由miRNA和长度与其相似但不完全互补配对的茎-环结构的对侧臂组成的。miRNA的对侧臂通常被命名为 miRNA*，然后 miRNA:miRNA*二聚体很快被引导进入RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)中，其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达［3-4］。前面所述的是在动物中miRNA的产生过程，而在植物中miRNA的产生过程却有所不同。植物中缺少Drosha同源异形体，pri-miRNA的两次剪切加工都在核内由Dicer酶的同源异形体DCL1催化完成，形成的miRNA/miRNA*二聚体由Exportin-5的同源异形体HASTY转运到胞质中与RISC复合物结合［5］。

最近的一些研究提示miRNA还有另外一种形成机制，称作 mirtrons。这类 miRNA是 pre-miRNA的内含子，这些miRNA不是从自身独立的启动子开始转录而来，而是由一些内含子加工形成。最先由内含子转录形成miRNA前体，然后再在Drosha酶的剪切作用下加工处理为成熟的miRNA［6-7］。成熟的miRNA和靶基因mRNA的3’UTR完全或不完全配对引起RISC降解目的mRNA片段或是阻碍其翻译。miRNA与靶mRNA不完全互补后，除了阻遏翻译外，还有引起mRNA快速脱腺苷酸化而被降解以抑制基因表达的作用［8］。最近也有研究表明，miRNA不仅可以和靶分子mRNA的3’UTR结合，还可以和编码区及5’UTR结合。Tay等［9］的研究显示，miRNA通过与靶分子mRNA的编码区结合，调节胚胎干细胞的分化。Pan等［10］发现肝脏特有的miRNA-122与丙型肝炎病毒RNA 5’UTR区相互作用引起病毒增殖。研究发现，不同组织或细胞在不同阶段表达着不同的miRNA谱。一个miRNA可调节数百个靶基因，包括细胞因子、转录因子等，miRNA与靶基因组成了复杂的调节网络［11-12］。相对于蛋白水平的调节，miRNA水平的调节显得更加节省能量，效率更高而且可逆，大多数miRNA对靶基因起着微调作用，少数miRNA调节也可引起很明显的表型改变。

3 miRNA的功能和意义

miRNA作为一种新近发现的小分子RNA，其在生物体内起着重要的作用，包括发育进程、造血过程、器官形成、凋亡、细胞增殖和肿瘤的发生等。随着检测 miRNA表达的方法日趋成熟，如 qRTPCR［13］、miRNA 芯片技术［14］、锁定核酸的定量分析［15］等，对于miRNA的研究也有了较大的进步，一些miRNA的功能已经被我们所认知。在哺乳动物的胚胎发育过程中，miRNA在组织分化中也起着较为重要的作用。大脑特异 miRNA，如 miRNA-9和miRNA-124a能够影响体外培养的胚胎干细胞神经谱系的分化。2006年，Schratt等［16］报道 miRNA-134在鼠中枢神经系统发育中对于神经突触的可塑性、发育成熟等方面具有特异性的调节作用。两种miRNA在骨骼肌基因定向分化中发挥着作用，miRNA-1通过靶向抑制组蛋白脱乙酰基酶-4转录来促进肌组织的形成，从而起到抑制骨骼肌基因转录的作用;miRNA-133则通过抑制血清反应因子促进成肌细胞增殖［17］。

最近几年，miRNA介导的转录后基因沉默与肿瘤形成的相关性已成为研究的热点。现在很多相关文献报道miRNA对很多肿瘤相关基因具有抑制作用，并且被证实在未来对肿瘤的诊断和治疗方面都有着不可估量的前景。例如miRNA-15a、miRNA-16和let-7在多种肿瘤中存在，并且均表现为下调，说明它们可作为肿瘤的抑制基因［18］。同时也有研究表明，miRNA也可以促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。Eis等［19］在B细胞淋巴瘤的研究中发现，在各种类型的B细胞淋巴瘤组织中miRNA-155的表达较正常组织高10～30倍，且恶性程度越高、预后越差、弥散性大的B细胞淋巴瘤miRNA-155增高尤为显著。Calin等［20］和 Volinia等［21］认为 miRNA 表达差异可以用来正确区分不同种类及亚型的肿瘤，而且可以作为判断肿瘤预后的辅助手段。研究显示，let-7在肺癌中表达降低，其表达水平越低是肿瘤预后差的生物标记［22］。

近年来，很多相关研究发现，一种miRNA可以参与数百种靶mRNA的调控［23］，其潜在的影响几乎作用于每条基因通路;而很多种miRNA也可能同时作用于同一种mRNA［24］。根据miRNA在基因调控中的作用特点，设想应用miRNA对疾病进行治疗时，可以“一石多鸟”，即可通过对某种特定miRNA进行调控，从而达到治疗多种疾病的效果;也可以“多石一鸟”，即可通过对一些相关的miRNA进行调控，从而达到对某种特定疾病的治疗效果。对miRNA基因表达调控功能及其作用机制的进一步研究，将对基因功能研究、生物进化探索和人类疾病防治具有重大意义。

4 miRNA与DR

DR是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，其主要的特征是视网膜微血管功能障碍，最严重的后果是导致失明，它已成为大多数发达国家工作年龄人群致盲的首要原因。研究发现，糖尿病患者比非糖尿病患者发生视力损害的危险性高25倍［25］，每年仅在美国就有12 000～24 000例患者因DR而失明［26］。DR发生的确切机制目前仍未完全清楚。就当前的研究而言，DR是一个多基因、多阶段的疾病，其病理改变涉及代谢酶、炎症、细胞周期、细胞生长、细胞增殖、信号转导、细胞外基质及离子通道等相关基因的变化。由于DR的发病机制错综复杂，其确切有效的治疗方法也没有最终明确。学者们普遍认为早期有效控制血糖、血压和血脂是治疗DR的关键措施;而激光光凝术和玻璃体切割术是手术治疗DR、预防新生血管形成的有效措施［27］。但是，这些方法均不能完全有效阻止视网膜新生血管的形成。miRNA与很多疾病的发生、发展有着密切的关系，进一步研究miRNA对DR新生血管的调节作用，对于深入探讨该疾病的致病机制及开发治疗新药有着长远的意义。

近年来，一些研究表明很多特异性的miRNA在眼球组织包括角膜、晶状体、视网膜中均有特定性的表达，并具有一定特点。据文献报道，miRNA-9、miRNA-23b、miRNA-26a、miRNA-30c、miRNA-125b、miRNA-181、miRNA-182、miRNA-183、miRNA-184、miRNA-204、miRNA-205、miRNA-210、miRNA-211、miRNA-219、miRNA-320在视网膜组织中均有特异性的表达［28-31］。深入研究这些miRNA的时间及空间分布对于进一步研究它们的作用靶点及它们如何影响视网膜的发育和功能，以及它们如何在DR中起调节作用，对治疗DR至关重要。Arora等［30］认为许多miRNA在视网膜中具有调节视网膜功能的重要作用。各物种间视网膜miRNA具有较高的保守性，miRNA改变可能导致视觉功能的破坏。他还对人及鼠视网膜miRNA表达进行了分析，结果发现视网膜组织中有67种miRNA可对以往报道的320种视网膜基因中的一个或多个进行调节。Kovacs等［32］采用链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型，通过与对照组对比分析，发现在两组视网膜中有350种miRNA，其中86种miRNA表达有差异;视网膜内皮细胞中检测出220种miRNA，其中120种miRNA表达有差异。通过基因功能注释分析发现，miRNA-146通过作用于白细胞介素-1受体相关激酶1和肿瘤坏死因子受体相关因子6，抑制了核转录因子-κB的活化。与血管内皮生长因子诱导有关的miRNA-17-5p、miRNA-18a、miRNA-20a、miRNA-21、miRNA-31、miRNA-155等的表达都有增加。与p53相作用的miRNA-34家族在糖尿病组的表达上调，表明p53依赖的miRNA-34介导的细胞凋亡可能在早期DR中起到重要作用。

目前，已有较多miRNA作用于视网膜新生血管机制方面的研究报道。Kuehbacher等［33］采用在体外培养脐静脉内皮细胞和在裸鼠皮下注射经过RNA干扰技术抑制Dicer酶和Drosha酶处理的脐静脉内皮细胞后，通过进一步的分析发现新生血管萌芽及管壁的形成被明显地抑制，其中抑制Dicer酶组在体内体外都明显地抑制了内皮细胞的移行，但抑制Drosha酶组在体外作用甚微，体内则无此作用。通过体外细胞miRNA的提取分析，共有168种miRNA表达，其中发现 let-7家族、miRNA-21、miRNA-126、miRNA-221和miRNA-222在血管内皮细胞中均有较高水平的表达，抑制Dicer和Drosha酶后，let-7家族和miRNA-27b的高表达被抑制，同时采用let-7家族和miRNA-27b的抑制剂也可抑制新生血管管壁的形成，进一步的实验发现这些作用都与血小板反应素-1有关，因此认为let-7家族和miRNA-27b与新生血管的发生有密切的关系。McArthur等［34］利用基因芯片技术，对已经出现DR的大鼠视网膜和高糖刺激下的人视网膜血管内皮细胞进行对比筛查，发现miRNA-200b的表达显著增高，同时血管内皮生长因子的mRNA和蛋白表达也增高。在视网膜中，miRNA-200b定位于神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞。通过基因干扰技术阻断miRNA-200b的表达，可明显降低血管内皮生长因子mRNA和蛋白的表达;同时也阻碍了糖尿病引起的视网膜血管通透性的增加和新生血管的生成。因此，针对miRNA的研究可能成为未来DR治疗的新靶点。

5 展望

miRNA的发现为中心法则中RNA次要中介作用提供了重要补充，为非编码RNA参与基因调控提供了一个很好的范例。目前，虽然人类对miRNA及其在DR领域的研究已取得一些进展，但仅是冰山一角，仍需进行更为深入与广泛的研究。miRNA在DR中的研究目前还面临很多问题。例如，如何准确地分离miRNA分子，miRNA与靶mRNA之间的调控关系，miRNA之间是否也存在可相互调控的关系，如何寻找在DR中的特异的miRNA表达谱，怎样开发出与之相应的有效药物等。基因芯片和生物信息学是近年来新发展起来的科学技术，运用生物信息学和miRNA基因芯片技术将有助于新miRNA的鉴别及其功能鉴定、靶基因的预测，以及相应药物的研发。这必将对DR的研究、预防和治疗掀开新的篇章。

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