疏水性胆汁酸诱导肝细胞损伤机制研究进展

王 锋综述，李 克审校

综述

疏水性胆汁酸诱导肝细胞损伤机制研究进展

王 锋综述，李 克审校

疏水性胆汁酸又称毒性胆汁酸，在胆汁淤积性肝病中，毒性胆汁酸在肝内滞留，可通过氧化应激反应诱导细胞线粒体功能紊乱和内质网应激、刺激促炎性介质产生以及激活死亡受体等方式导致肝细胞的损伤、坏死和凋亡。毒性胆汁酸在胆汁淤积所致肝损害过程中起重要作用，文中就疏水性胆汁酸诱导肝细胞损伤的几种常见机制作一综述。

疏水性胆汁酸;肝细胞;氧化应激;内质网应激

0 引 言

胆汁淤积能导致疏水性胆汁酸的储留。疏水性胆汁酸在肝细胞的蓄积被认为是肝损伤的一个重要因素。近年研究发现，疏水性胆汁酸诱导肝细胞损伤过程涉及到线粒体途径、内质网应激、死亡受体途径的参与，这可能与肝细胞的凋亡和坏死相关。

1 疏水性胆汁酸定义和分类

胆汁酸分子内既含有亲水性的羟基及羧基，又含有疏水性烃核和甲基。亲水基团均为α型，而甲基为β型，2类不同性质的基团恰位于环戊烷多氢菲核的两侧，这种构型使得胆汁酸有疏水性和亲水性2种性质。疏水性胆汁酸包括胆酸(cholic acid， CA)，脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)，鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)，鹅脱氧甘胆酸(glycochenodeoxycholic acid，GCDCA)和石胆酸(lithocholic acid，LCA)，其疏水性的大小顺序依次为CA＜CDCA＜DCA＜GCDCA＜LCA［1］。

2 疏水性胆汁酸引起的肝细胞损伤

疏水性胆汁酸能破坏细胞基底外膜、细胞器膜并特异性破坏微管膜的外层。有学者用表面积较大的单层泡膜做了一些实验，结果显示随着毒性胆汁酸浓度的增加，其与膜的结合能力也增加，当达到某一程度时疏水性胆汁酸和膜会相互作用导致瞬时的膜洞形成，破坏细胞膜完整性并使肝细胞溶解。在胆汁淤积症肝细胞中CDCA和DCA的蓄积是导致肝细胞损伤的一个主要原因［2］;这些疏水性胆汁酸可导致肝细胞肿胀和细胞内胆色素的蓄积，损伤的肝细胞中的线粒体呈现出肿胀、多形性等异常形态以及生长因子、细胞因子、趋化因子以及脂质过氧化物的产生。疏水性胆汁酸通过对细胞膜脂质的去垢作用破坏细胞膜的完整性，促进活性氧的产生并氧化修饰脂质、蛋白以及核酸，导致肝细胞的损伤。

3 疏水性胆汁酸诱导肝细胞损伤的机制

3.1 炎症反应机制 在胆汁淤积症中，炎症是导致肝损伤的原因之一。关于胆汁淤积症中炎症是如何引起的，目前有2种假设:其一，细菌脂多糖或死亡的肝细胞释放的死亡相关分子，活化了Toll样受体4(toll-like receptor，TLR 4)，从而激发了炎症应答。其二，疏水性胆汁酸作为炎症刺激剂，直接活化肝细胞内的信号途径，刺激了促炎介质的产生。研究发现，具有抗细菌脂多糖能力的C3H/HeJ大鼠胆管结扎后，炎症反应不受影响;而用疏水性胆汁酸处理过的肝细胞能增加促炎介质的大量表达，如细胞色素、炎症趋化因子、黏附分子及其他影响免疫细胞水平和功能的蛋白。此研究证实了在胆汁淤积疾病中，炎症反应并不是由于细菌脂多糖或是坏死的肝细胞释放的死亡相关分子诱导TLR 4的活化，而是疏水性胆汁酸作为炎症刺激剂活化肝细胞内的信号转导途径，直接刺激促炎介质的产生［3］。在胆汁淤积疾病中，DCA和CDCA通过某种机制激活表皮生长因子受体(endothelial growth factor receptor，EGFR)而上调肝细胞中的早期生长反应基因-1(early growth response gene-1，Egr-1)，Egr-1通过直接或间接作用增加肝细胞内促炎介质如细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1)和血管内皮细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1)［4］、白细胞介素-10(interlenkin，IL-10)和IL-1β表达，这些介质又进一步刺激如中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞的活化［5］。此外，疏水性胆汁酸通过刺激细胞因子的产生引起T淋巴细胞的蓄积，这些都可导致肝细胞的病理损伤［6］。

3.2 线粒体途径 疏水性胆汁酸能通过线粒体途径诱导细胞的损伤，细胞内的应激反应引起线粒体机能发生障碍:过量活性氧的产生和内膜通透性的改变。

3.2.1 疏水性胆汁酸诱导线粒体产生过量的活性氧 疏水性胆汁酸通过破坏肝线粒体的呼吸复合物及电子传递链来刺激线粒体产生过量的活性氧。疏水性胆汁酸能直接损伤线粒体呼吸链复合物Ⅲ，降低了呼吸态3的呼吸比率，潜在刺激呼吸链上游活性氧的生成，过量的活性氧又可氧化线粒体内源性抗氧化物，如谷胱甘肽和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，放大氧化应激反应，进一步增加线粒体内一系列活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的生成［7］。另外ROS还能直接氧化线粒体膜孔蛋白复合物上的邻位硫氢基团而诱导线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放，加速ROS的产生。

3.2.2 疏水性胆汁酸诱导线粒体内膜通透性的改变 线粒体通透性转换(mitochondrial permeability transition，MPT)主要是指由MPTP控制的内膜通透性突然的升高。MPTP位于线粒体内外膜之间，是由多个蛋白质组成的复合通道。MPTP的开放有2种状态:一种是低电导性通道，是一种短暂和可逆的开放，可能参与钙离子的释放或ADP的转运;另一种是高电导性通道，是一种病理性的不可逆开放，可导致细胞的凋亡或坏死。疏水性胆汁酸可能是通过后一种MPTP的开放状态导致MPT发生而产生毒性作用。MPTP高水平开放的直接效应是导致线粒体质子、电化学梯度耗散，离子稳态被打破，大量的高分子物质进入线粒体基质，导致基质的高渗性，引起基质体积膨胀，最终使线粒体外膜被破坏和ATP水解，导致MPT的发生，而MPT的发生直接导致了ATP水平下降，细胞质水平钙离子水平上升，线粒体跨膜电位破坏，凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)及细胞色素C(cytochrome C，CytC)释放［8－9］，这些效应都可致细胞死亡。环胞菌素 A (cyclosporine，CsA)是调控MPTP开放最强有力的抑制剂［10］，实验证实［11］，加入CsA预处理线粒体，MPT现象可明显被CsA抑制，验证了疏水性胆汁酸确实是通过诱导MPTP的开放导致MPT发生而影响线粒体功能的。研究证实［12］在DCA诱导的细胞凋亡过程中，线粒体膜电位减低，Bax亚细胞结构分布的改变，并出现线粒体相关Bax蛋白水平的升高，这些都证实了疏水性胆汁酸诱导MPT是启动事件。初始的MPT导致了CytC的释放，CytC的释放促使Bax转移到线粒体上，进而促发更多CytC的释放，最终导致肝细胞的死亡。

3.3 内质网途径 疏水性胆汁酸还能通过内质网应激(endeplasmic reticulm stress，ERS)介导肝细胞损伤。内质网是调节钙离子稳态水平和钙离子信号转导的主要部位，钙离子稳态的破坏可导致ERS。在胆汁淤积症中ERS是由ERS特异的转录因子CHOP蛋白介导的。疏水性胆汁酸不仅可诱导线粒体应激产生活性氧，也能诱导内质网释放钙离子入细胞质中，细胞质钙离子水平的升高可引起线粒体应激产生大量的活性氧，而活性氧的产生又进一步促进钙离子浓度持续的升高［13］，引起内质网摄取和释放钙离子功能障碍，ERS激活了特异性的促凋亡转录因子CHOP的表达，进而抑制蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)的活性，促使细胞凋亡。CHOP的缺乏可减少细胞死亡和继发性的肝细胞纤维化，进一步证实了CHOP在肝纤维化和胆汁淤积肝损伤中起到的至关重要的作用［14］。ERS与氧化应激相互关联，未折叠蛋白反应(the unfolded protein response，UPR)可聚集内质网或线粒体依赖性簇，延长UPR可激活氧化应激，而氧化应激时产生大量的ROS也可激活 ERS［15］。持久的 ERS，过表达的Ca2+结合蛋白可磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶、内质网跨膜激酶，上调生长抑制DNA损伤基因153等信号表达，活化ERS途径，引起肝细胞损伤［16］。

3.4 死亡受体途径 疏水性胆汁酸在肝细胞的蓄积造成细胞死亡存在2种机制:较低浓度的疏水性胆汁酸会诱导肝细胞的凋亡［17］，而高浓度的疏水性胆汁酸则会诱导细胞坏死［18］。细胞凋亡与坏死最重要的区别是，前者能维持完整的细胞膜功能，并且细胞器结构完整。在某些大鼠模型中，肝细胞主要的死亡形式是细胞坏死［19］。在胆汁淤积造成的肝细胞损伤中，凋亡机制已被证实，疏水性胆汁酸的毒性并不只是与本身的疏水性相关，还取决于它们的浓度和结合状态，这与细胞坏死的情况不同。

3.4.1 肝细胞凋亡 疏水性胆汁酸诱导的肝细胞凋亡是通过死亡受体Fas和TRAIL-R2完成，其作用机制部分是通过对蛋白酶级联反应的激活:最先以Fas受体依赖方式激活Caspase 8，继而激活组织蛋白酶B。体外实验表明，以上2种蛋白酶其中任一种活性被抑制均能减少细胞的凋亡，表明这2种蛋白酶在胆汁酸诱导的细胞凋亡中起着关键作用。Fas受体非依赖机制是通过毒性胆汁酸在膜上的聚集完成的。疏水性胆汁酸诱导的氧化应激不仅能刺激Fas受体的转运，还能激发C-JUN N末端激酶和蛋白激酶C活性，从而进一步激活内皮生长因子，促使Fas受体磷酸化，诱导其转移至细胞膜上并在膜上活化［20］。细胞表面Fas受体密度的增加使得肝细胞对 Fas受体诱导的细胞死亡途径更加敏感［21］。所以，毒性胆汁酸能通过激活Fas受体来诱导肝细胞的凋亡。当死亡受体被激活以及死亡诱导信号复合物形成后，Caspase 8亦被激活，凋亡蛋白前体被切割并转位至线粒体上，从而导致MPTP打开，进而使得CytC和膜间隙内的凋亡小分子前体的释放。其中CytC导致凋亡蛋白酶激活因子1和Caspase 9前体结合并激活后者。这种Caspase系统的级联反应作用最终导致肝细胞的不可逆性死亡［22］。死亡受体TRAIL-R2也参与胆汁酸诱导的细胞凋亡，在Fas受体有缺陷的细胞以及GCDCA诱导的凋亡过程中发现这些死亡受体的高表达和低聚化现象。

3.4.2 肝细胞坏死 在大鼠肝细胞中，细胞的坏死是以细胞肿胀和细胞内膜及外膜的崩解为特征。疏水性胆汁酸的去垢作用可直接破坏细胞膜，从而造成肝细胞致死性的损伤，这一过程包括细胞ATP的耗尽，离子平衡的失调，线粒体和细胞的肿胀，细胞膜的破坏和细胞的溶解，大量的细胞内容物的释放等。在胆汁淤积症患者的肝组织病理学中显示，有大量的肝细胞出现肿胀，并且血清中的转氨酶含量也有升高现象。研究表明，抗氧化剂能够阻断肝细胞的坏死，减少暴露在疏水性胆汁酸的单个细胞的氧化应激作用，以及抑制线粒体膜电位的消耗。

4 结 语

胆汁淤积症中，疏水性胆汁酸是导致肝细胞损伤、凋亡或坏死的主要因素。因此，如何有效的控制病理条件下疏水性胆汁酸对肝细胞的毒性作用是一个亟需解决的问题。依据疏水性胆汁酸对肝细胞损伤机制，我们可以考虑对疏水性胆汁酸诱导肝细胞损伤途径进行干预，从而控制和减少肝细胞损伤。

［1］ Thomas C，Pellicciari R，Pruzanski M，et al.Targeting bile-acid signalling for metabolic diseases［J］.Nat Rev Drug Discov，2008，7(8):678-693.

［2］ Attili AF，Angelico M，Cantafora A，et al.Bile acid-induced liver toxicity:relation to the hydrophobichydrophilic balance of bile acids［J］.Med Hypotheses，1986，19(1):57-69.

［3］ Allen K，Kim ND，Moon JO，et al.Upregulation of early growth response factor-1 by bile acids requires mitogen-activated protein kinase signaling［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2010，243(1): 63-67.

［4］ 庄卓男，张培健.早期生长反应因子-1对肝脏损伤的作用机制研究进展［J］.医学研究生学报，2011，24(6):662-665.

［5］ Wintermeyer P，Cheng CW，Gehring S，et al.Invariant natural killer T cells suppress the neutrophil inflammatory response in a mouse model of cholestatic liver damage［J］.Gastroenterology，2009，136(3):1048-1059.

［6］ Allen K，Jaeschke H，Copple BL，et al.Bile acids induce inflammatory genes in hepatoytes a novel mechanisn of inflammation during obstructive cholestasis［J］.Am J Pathol，2011，178(1): 175-186.

［7］ Krahenbuhl S，Tales C，Fischer S，et al.Toxicity of bile acids on the electron transport chain of siolated rat liver mitochandria［J］.Hepatology，1994，19(2):471-479.

［8］ 沈 方，沈 倩，夏 强.细胞凋亡与线粒体通透性转换孔的研究进展［J］.浙江大学学报，2005，34(2):191-196.

［9］ 刘丽君，彭建新，洪华珠.线粒体在细胞凋亡中的变化与作用［J］.细胞生物学杂志，2005，27(2):117-120.

［10］ Anabela PR，Paulo JO，Antonio JM，et al.Chenodeoxycholate is a patent inducer of the permeability transition pore in rat liver mitochondria［J］.Biosci Rep，2001，21(1):73-80.

［11］ 刘 菁，魏慇娜，沈萍萍.线粒体膜通透性在微囊藻毒素诱导的小鼠肝细胞凋亡中的作用［J］.卫生研究，2011，40(1): 53-56.

［12］ Rodrigues CM，Ma X，Linehan-Stieers C，et al.Ursodeoxycholic acid prevents cytochrome c release in apoptosis by inhibiting mitochondrial membranedepolarization and channel formation［J］.Cell Death Differ，1999，6(9):842-854.

［13］ 周映彤，肖洪彬，毕明刚.活性氧与内质网应激［J］.中国药理学通报，2011，27(5):597-600.

［14］ Tamaki N，Hatano E，Taura K，et al.CHOP deficiency attenuates cholestasis-induced liver fibrosis by reduction of hepatocyte injury［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294 (2):498-505.

［15］ 沈丽敏，吴晨光.氧化应激及其介导的细胞凋亡在糖尿病肾病中的作用［J］.医学研究生学报，2008，21(11):1222-1225.

［16］ 李 静，夏正坤.内质网应激与膜性肾病［J］.医学研究生学报，2011，24(5):542-545.

［17］ Yerushalmi B，Dahl R，Devereaux MW，et al.Bile acid-induced rat hepatocyte apotosis is inhibited by antioxidants and blockers of the mitochondrial permeability transition［J］.Hepatology，2001，33(3):616-626.

［18］ Sokol RJ，Winklhofer-Roob BM，Devereaux MW，et al.Generation of hydroperoxides in isolated rat hepatocytes and hepatic mitochondria exposed to hydrophobic bile acids［J］.Gastroenterology，1995，109(4):1249-1256.

［19］ Fickert P，Trauner M，Fuchsbichler A，et al.Oncosis represents the main type of cell death in mouse models of cholestasis［J］.J Hepatol，2005，42(3):378-385.

［20］ Reinehr R，Becker S，Eberle A，et al.Involvement of NADPH oxidase isoforms and Src family kinases in CD95-dependent hepatocyte apoptosis［J］.J Biol Chem，2005，280(29):27179-27194.

［21］ 张柏林.Fas及Fas配体基因多态性与肿瘤发生风险的关系［J］.中国乳腺病杂志，2009，3(3):53-55.

［22］ Yin XM，Ding WX.Death receptor activation-induced hepatocyte apoptosis and liver injury［J］.Curr Mol Med，2003，3(9): 491-508.

Mechanisms of hydrophobic bile acid mediating hepatocyte injury

WANG Fengreviewing，LI Kechecking
(Department of Laboratory Medicine，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，PLA，Nanjing210002，Jiangsu，China)

Hydrophobic bile acid(HBA)，also called toxic bile acid，accumulates in the liver of the patient with cholestatic diseases.Through oxidative stress response，it may induce mitochondrial function disorder and endoplasmic reticulum stress，stimulate the production of inflammatory mediators and activate the death acceptor，resulting in the damage，necrosis and apoptosis of liver cells.HBA plays an important role in cholestasis-induced hepatocyte injury.This article outlines some common mechanisms of HBA mediating hepatocyte injury.

Hydrophobic bile acid;Hepatocyte;Oxidative stress;Endocytoplasmic reticulum stress

R575.22

A

1008-8199(2012)08-0882-04

210002南京，南京军区南京总医院临床检验科［王 锋(医学硕士研究生)、李 克］

李 克，E－mail:liker1017@163.com

2011-12-28;

2012-01-20)

(责任编辑:缪 琴;英文编辑:罗永合)