深部真菌感染的实验室诊断分析

文兴东

（荔浦县人民医院，广西 荔浦546600）

近年来，随着广谱抗生素、抗肿瘤药物、皮质类固醇激素及免疫抑制剂的开发和应用，介入治疗、器官移植、骨髓移植术及导管插管等技术的普遍开展，免疫障碍以及艾滋病的流行，医院真菌感染，特别是深部真菌感染所占比例正在逐年上升［1］，已成为医院感染的又一新难题。深部真菌［2］主要有念珠菌、隐球菌、曲霉、毛霉、组织胞浆菌和卡氏肺孢菌等。深部真菌可累及全身各个部位和系统，其中受累脏器频率最高的为呼吸道，特别是下呼吸道，其次为泌尿道、胃肠道、神经系统等。由于院内深部真菌感染患者起病较隐匿，且临床表现无特异性等，病情易被基础疾病掩盖，给诊断带来了很大困难。对其早期、准确的诊断是治疗成败的关键。目前临床实验室主要借助显微镜检查、培养、血清学、分子生物学等手段对真菌感染进行检测，现将近年来深部真菌感染的实验室诊断介绍如下。

1 显微镜检查

显微镜检查是检查真菌感染最快速有效和廉价的方法，包括直接镜检和染色后镜检（革兰染色、墨汁染色、瑞氏染色等），主要是通过真菌形态学特征（包括孢子、菌丝和假菌丝等）对真菌进行初步鉴别。对临床标本直接涂片、镜检，方法简便、快速，但是阳性率较低，阴性结果不能直接排除诊断，大多数菌种都不能直接根据结果来确定。王凤玲等［3］对呼吸内科的286例呼吸系统感染疾病患者行痰涂片染色镜检直接检测真菌，将检测结果与真菌培养法的检测结果进行比较，结果显示镜检法真菌检出率略高于培养法的检出率，但两种方法差异无统计学意义，表明应用超高倍显微仪痰涂片检测真菌准确率较高，是一种简便、快速诊断呼吸系统真菌感染的筛查方法。

2 真菌培养

真菌培养作为传统的诊断深部真菌感染的方法，是目前各实验室检测真菌感染的基本环节。各种镜检法的阳性率均低于培养法。它能明确引起感染的真菌种类名称，并可用相应真菌进行药敏试验。但也有一定弊端，培养结果要结合直接镜检的结果，必要时应多次重复检查；对于某些危险度处于1、2 类分级标准中的真菌还需注意安全防护；而且培养需要的时间相对较长［4］，一般需要48h，有时需要72～96h；同时在肺部真菌感染的诊断中，单纯根据痰液培养结果难以鉴别真菌是定植还是真正的真菌感染［5］。

3 血清学检查

目前真菌感染的血清学试验主要包括抗原抗体检测及代谢产物检测两大类。研究显示［6］，血清学诊断念珠菌感染的特异性和敏感性可分别达93% 和80%，且73% 的阳性结果可早于血培养2d，有些病例甚至可早于血培养15d。

3.1 抗原检测

近年来开展的真菌抗原检测，作为一种非侵袭性诊断方法，有着早期、快速、高灵敏度和特异度的优点，先后被欧洲国家、美国及中国制定的侵袭性真菌感染诊断和治疗指南列为临床诊断侵袭性真菌感染的微生物学标准之一。理想的真菌感染的抗原性标记［7］不应该太短暂，应该与感染相关而不是集群现象。它们应该在目标菌种内保守，不与人类和其他微生物抗原发生交叉反应，在抗真菌治疗开始前足够早出现。真菌感染血清抗原检查主要有半乳甘露聚糖、beta－葡聚糖、cond－Tec抗原和烯醇化酶等抗原［8］。

3.1.1 血浆葡聚糖试验

葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，在真菌细胞的生长代谢过程中可自然脱落下来而进入循环；当真菌减少时［9］，机体免疫系统将其迅速清除，而在浅部真菌感染时则无类似现象。Ostrosky－Zeichner等［10］对170 名健康志愿者和163例确诊或可疑深部真菌感染患者进行了检测，结果显示以≥60ng·L－1为阳性判定界值点，其总敏感度为69.9%，特异度为87.1%。虽然具有较高的诊断敏感度和特异性，但阳性率很低。葡聚糖检测只能提示有无真菌感染，不能明确为何种真菌，且会有一定数量的漏诊。

3.1.2 半乳甘露聚糖（GM）试验

GM 是曲霉菌细胞壁上的一种多糖抗原。研究显示［11］，血清GM 水平与组织的真菌负荷量成正比，动态监测血清GM 水平的变化有助于判断抗真菌治疗的效果。2003年，美国FDA 完成对该实验的临床评价，早期诊断优势突出，并批准GM 实验用于非免疫缺陷患儿侵袭性曲霉菌病（IA）的辅助诊断。但也有文献报道在儿童，尤其是小婴儿和新生儿的假阳性率则较高。目前公认的检测［12］GM 抗原最佳方法是ELISA 法，用ELISE 法检测高危患者中GM 曲霉抗原用于临床侵袭性曲菌的早期诊断在国外已被许可。

另外，还有隐球菌荚膜多糖抗原的检测是目前临床上诊断隐球菌感染的最重要方法之一，已被广泛应用；而由于甘露糖广泛存在于各种真菌细胞中，导致该检测方法特异度较低，限制了临床应用；烯醇化酶的抗原性较强，在体内清除较快，阳性率不如其抗体检测。

3.2 抗体检测

少数引起深部感染的真菌，其胞壁成分甘露聚糖及胞膜代谢产物阿拉伯糖可作为抗原产生相应抗体。孔晓祥等［13］通过实验研究表明，ELISA 法检测血清抗白念珠菌烯醇化酶抗体对诊断该菌深部感染有重要价值。

4 分子生物学检测

随着分子生物学技术的发展，包括PCR 法在内的多种分子生物学技术开始应用于真菌病的诊断和研究，其敏感性高、特异性强、重复性好、快捷方便等优点引起了广大学者的高度关注。但由于缺乏标准化和经过验证的商品化试剂，PCR 技术尚未常规应用于临床标本的诊断。同时，由于PCR强大的扩增能力与灵敏度，极微量的污染即可能导致假阳性结果。真菌DNA 的提取方法有很多种［14］，如氯化苄法、蜗牛酶破壁法、液氮研磨法等。有学者［15］用多重PCR测定法鉴定口腔念珠菌属，采用引物ITS1、ITS2、CA3 和CA4进行检测，结果能比培养法更准确检测出所有样本菌，说明多重PCR 是一种检测假丝酵母属的快速方法。Kanbe等［16］应用套式PCR 检测侵袭性曲霉感染，发现此方法特异性和敏感性均很高。

5 其他检验方法

真菌病的病理学检查在临床上非常重要，特别是在诊断深部真菌感染时意义尤为重大。它可根据镜下的形态作出初步的鉴定，但确切的感染菌种还要依靠真菌培养。有些真菌［17］如瘢痕疙瘩样芽生菌、鼻孢子菌等不能培养生长，只能依靠组织病理检查。但组织穿刺往往不易被患者接受，且穿刺部位及所取组织量也会影响诊断结果，临床开展受到一定的限制。席丽艳等［18］报导应用气相色谱－质谱选择离子法检测血浆中的D／L 阿刺伯醇，可以早期诊断系统性真菌感染。

大量临床资料表明，深部真菌感染的疗效及转归很大程度取决于早期诊断。由于各种诊断方法均有其优势和局限性，传统检测方法亦具有新的检测方法所不可替代的优点，如组织病理学检查仍是诊断的金标准等。寻找更具代表性的检测物质及非侵袭性的检测技术，广泛利用新技术提高检测速度、灵敏度和特异度，建立新的诊断方法，是日后进一步明确深部真菌感染的研究方向。

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