噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用

杨栋强综述，白雪帆审校

综述

噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用

杨栋强综述，白雪帆审校

噬菌体展示技术是近年发展起来的新技术，在研究蛋白质与蛋白质之间、抗原抗体之间的相互作用、新药开发、疾病诊断、疫苗研制以及病毒研究等方面具有广泛应用。文中就噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用现状作一综述。

噬菌体展示技术;汉坦病毒;多肽

0 引 言

噬菌体展示技术(phage display technology)始创于1985年。Smith等［1］首次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，创建了该技术。自1990年Scott等［2］将噬菌体随机多肽库应用于筛选抗原表位以来，已进行了大量的相关研究，有力地推动了病毒抗原表位的研究进程。1994年McCaffery等［3］最先构建了噬菌体多肽和抗体展示文库，开始了噬菌体展示技术广泛应用的新时代。20余年来，噬菌体展示技术已应用于抗体的制备、多肽及蛋白质和酶的制备等多个生物医学领域。

汉坦病毒(Hantavirus)感染可引起2种人类急性传染病，即肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征(Hantavirus pulmonary syndrome，HPS)［4］。全世界每年约有15万HFRS和HPS患者，病死率视感染的病毒型别而异，自0.1%～40%不等，其中HPS最高［5－7］。我国是世界上受HFRS危害最为严重的国家，自1949年至2010年年末，已累计报告HFRS发病近160万人，占同期世界总病例数83.75%以上［8］。汉坦病毒可作为重要的生物战剂应用于军事。对汉坦病毒及其相关疾病的防治研究已取得了很大进展，但其发病的分子机制尚未完全明确，也无特效的治疗措施，安全有效的减毒活疫苗或基因工程疫苗尚待开发。由于噬菌体展示技术在筛选病毒抗体和抗原表位方面的独特优势，在汉坦病毒的基础和应用研究方面得到了较为广泛的应用，本文就此作一综述。

1 噬菌体展示技术的原理和特点

1.1 噬菌体展示技术原理 噬菌体展示技术是一种基因表达筛选技术，该项技术将编码多肽的DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因重组后，以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达出多肽序列，实现对表型和基因型的同时研究。将化学合成的随机寡核苷酸序列插入噬菌体基因组，在噬菌体表面表达出各种氨基酸组合的短肽，通过与特定的靶标反应，从表达有各种外源性蛋白的噬菌体肽库中筛选出展示特定蛋白的噬菌体。通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体扩增，然后进行序列测定，获得相应的结构和功能信息，实现了高通量筛选。噬菌体展示技术是有效的分子筛选方法，在研究蛋白质间相互作用、寻找酶和受体的激动剂和拮抗剂、研制新型诊断试剂和疫苗以及在抗肿瘤和抗感染药物研究等方面均有重要价值。噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分为丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。目前主要的库类型有包括噬菌体抗体库、随机短肽库、多肽构象库、cDNA展示库、基因突变体展示库等［9－11］。

1.2 噬茵体展示技术的特点 噬菌体展示技术简单易行，采用经典的PCR分子克隆等技术即可操作，在数周内即可筛选106～108个克隆，筛选获得的抗体库可用于原核系统表达，无需组织培养，极大地降低了成本。通过噬菌体展示技术制备的抗体库抗体多数是抗原结合片段(Fab片段)或单链抗体(ScFv)，对抗体的亲和力有一定的影响，但如对某些抗体基因进行改造，同样可以获得亲和力强的抗体。筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩增等突出优点。展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面，是探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具，在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗的研制、以及药物的开发等领域具有广泛应用前景［12－13］。

2 噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用

2.1 抗原表位检测 抗原表位的研究一直是微生物学和免疫学领域的热点。上世纪末，研究者重视病毒抗原表位的深入研究，为了寻求简捷而可靠的探索途径和方法，发现并建立了噬菌体展示技术。经过多年的发展和完善，完全能够作为抗原表位研究的操作简便、高通量、低成本和可调控的实用性平台。而且，在众多类型载体中，丝状噬菌体PⅢ蛋白N端容纳的外源蛋白与抗原表位大小匹配［14］，这种“不谋而合”足以避免表位研究中的“节外生枝”，因而更适合于表位信息肽库的构建。噬菌体展示技术的应用，使汉坦病毒抗原表位的筛选和鉴定以及小分子多肽疫苗的研究步入了快速发展阶段。

白雪帆等［15－16］用多株具有不同反应谱的国产单克隆抗体对呈现在噬菌体表面的汉坦病毒76－118株随机核衣壳蛋白多肽片段进行了免疫筛检，结果表明汉坦病毒N端从读框内启始密码(第1个氨基酸)起至第86位氨基酸的范围内为该病毒的主要的线性表位，该表位可被我国学者制备的广谱(组特异性)单抗L13F3 BI1和型特异性单抗5H5 (野鼠型)及R31(家鼠型)所识别。此外还发现，汉坦病毒核衣壳蛋白氨基端表位的抗原强度与其大小成正比。为病毒分子生物学研究和诊断抗原的研制提供了重要的资料。对本研究证实的表位进行深入研究有可能进一步从分子水平上揭示汉坦病毒的抗原和功能特性。

李光玉等［17］应用型特异性单克隆抗体5H5淘筛噬菌体随机9肽库，找到了该株单抗识别的较小的多肽表位。并证实了HTNV N端1～86位氨基酸的范围，是该病毒的主要线性表位，从分子水平上加深了对HTNV NP表位的认识，为免疫诊断和小分子多肽疫苗的合理设计提供了有价值资料。该研究结果也进一步证明，噬菌体随机肽库是筛选病毒抗原表位的有效和可靠的工具。王长军等［18］用噬菌体展示技术通过3～4轮生物淘选，筛选到与单抗F3特异性结合的阳性克隆，氨基酸序列均为MHG-PTKNQMWHT，并且与汉坦病毒M蛋白G2区第750～759位氨基酸具有较高的同源性，进一步的动物试验表明，所得肽段是天然病毒抗原较好的免疫原模拟肽，为根据表位制备汉坦病毒多肽疫苗及DNA疫苗提供了材料。

2.2 汉坦病毒抗体的研究 病毒抗体被广泛用于病毒诊断和被动免疫治疗。目前用于检测病毒的抗体主要来源于小鼠杂交瘤细胞，在筛选单克隆抗体生产杂交瘤细胞株系上，需要做杂交融合，亚克隆筛选，是长期复杂的过程，费时费力。噬菌体展示技术的出现，彻底改变了真菌毒素抗体及抗原制备的传统途径，利用此技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体。噬菌体抗体库有3种类型，即天然抗体库、合成抗体库和免疫抗体库。噬菌体技术发展至今，已可在2周内根据靶分子筛选出相应的具有高亲和力的抗体。

白雪帆等［19］用DNaseⅠ随机降解汉坦病毒76－118株S基因，回收50～300 bp的DNA片段，与克隆接头连接后插人经SfiⅠ线性化的噬菌体载体fuse5，电穿孔导入MC1061菌建库。转化菌培养扩增后提取重组噬菌体，感染K91细胞测定库容，并随机挑选若干克隆测序。对文库的粗测表明该文库基本可以满足抗体筛检实验的要求。侯颖春等［20］以3种方法从出血热恢复期患者外周血淋巴细胞成功地扩增出人抗体v区3种基因片段(VH，VK，Vλ)，通过搭桥拼接延伸反应(SOE)。以(Gly4Ser)3为连接子，将重、轻链v区基因连接成为VH-Linker-VK和VH-Linker-Vλ两种单链抗体(ScFv)基因。然后将SeFv基因与载体pHEN1重组，转染感受态大肠杆菌TG1，通过辅助噬菌体M13KO7的超感染，制备成两种噬菌体展示人源性全套ScFv抗体文库，为从噬菌体抗件库中筛选所需抗体基因进行测序和表达提供了基础。

Koch等［21］从感染汉坦病毒康复期患者的外周血淋巴细胞中用逆转录和PCR方法构建抗体库，继而用完整的汉坦病毒76－118株为靶分子，从构建的抗体库中筛选病毒特异性抗体，经过3轮淘洗后，筛选出5株与汉坦病毒有较强结合能力的抗体，将这5株抗体重组表达后研究发现全部具有中和汉坦型和汉城型病毒(Seoul virus)的功能，其中3株还能中和多布拉伐病毒(Dobrava virus)。深入研究发现这些抗体可以识别汉坦病毒G2蛋白上的2个表位916-KVMATIDSF-924和954-LVTK-DIDFD-963，该表位对于病毒入侵宿主细胞至关重要，对HFRS的预防和治疗研究具有借鉴价值。

2.3 筛选抗汉坦病毒多肽 时至今日，国际权威的美国食品药品监督管理局仍未批准包括利巴韦林等任何针对汉坦病毒相关疾病如HFRS和HPS的特效治疗药物［22］。因此，探讨汉坦病毒感染致病的分子机理，寻找有效的抗病毒治疗药物仍是当前及今后HFRS防治的重要任务。抗微生物肽是近年发现的新型生物活性分子。短肽或寡肽类分子具有分子量小、穿透力强、抗原性弱、活性强、易于制备且容易与靶分子结合等优点，是当前癌肿和感染等治疗极好的靶向药剂。功能性多肽的筛选工作量十分浩大，需要高通量的筛选技术，而噬菌体展示技术可满足该项工作的需要。噬菌体展示技术是选择技术，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种称为淘选(biopanning)的体外选择程序得以快速鉴定。由于噬菌体表面展示的多肽能够与靶分子结合，因而可以通过亲和筛选从噬菌体多肽库中筛选出与靶分子特异性结合的多肽，即让多肽模拟配体的结合部位与靶分子结合，测得配体与受体的结合位点，多肽序列则可以通过测定噬菌体所插入的外源DNA序列而得知［23－26］。

Larson等［27］应用αvβ3分子对展示环状九肽的噬菌体肽库进行淘筛，发现了70个可与β3整合素结合的九肽，这些肽可以不同程度地减少汉坦病毒属中的辛诺柏型病毒(Sin Nombre virus，SNV)和汉滩型病毒(Hantaan virus，HTNV)的空斑形成数。经比较证实其中8个短肽与SNV的囊膜糖蛋白具有较高的同源性。作者合成了其中4个肽段，证明部分肽段的组合可提高阻断SNV病毒感染的效果，为进一步设计和获取更高活性的抗汉坦病毒短肽提供了重要资料［28］。Hall［29］等针对安第斯病毒(andes virus，ANDV)表面囊膜糖蛋白Gn和GC应用抗体竞争性洗脱9肽库，所得噬菌体完成了体外阻止ANDV的活性实验，在此基础上尝试合成了相应的多肽序列，其中3个肽段显示出明显的病毒抑制作用。这些肽段的发现为抗汉坦病毒多肽类药物的研究提供了基础。

3 结 语

噬菌体展示技术出现只有20余年的历史，如许多其他新技术一样，该项技术也存在自身的难点和问题，有些甚至是未曾预料到的。但随着其应用范围的不断扩大，不断地得到完善。噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用必将增进人类对汉坦病毒的认识。近年研究表明β3整合素是汉坦病毒的关键受体，封闭或阻断β3整合素已成为抗汉坦病毒治疗研究的重要策略［30］。通过对噬菌体展示短肽库的筛选，获得能够特异高效拮抗汉坦病毒感染的肽段，并进一步通过特定肽段的改构和不同组合提高其抗病毒活性，有助于研制新型抗汉坦病毒多肽类药物。

［1］ Smith GP.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface［J］.Science，1985，228(4705):1315-1317.

［2］ Scott JK，Smith GP.Searching for peptide ligands with an epitope library［J］.Science，1990，249(4967):386-390.

［3］ Henry R，Kapazoglou A，McCaffery M，et al.Differences between lumen targeting domains of chloroplast transit peptides determine pathway specificity for thylakoid transport［J］.J Biol Chem，1994，269(14):10189-10192.

［4］ Schmaljohn C，Hjelle B.Hantaviruses:a global disease problem［J］.Emerg Infect Dis，1997，3(2):95-104.

［5］ Guzman GP，Tapia EO，Villaseca HM，et al.Morphological findings in fatal cases of hantavirus cardiopulmonary syndrome.Report of 7 autopsies［J］.Rev Chilena Infectol，2010，27(5):398-405.

［6］ Borges A，Figueiredo LT.Mechanisms of shock in hantavirus pulmonary syndrome［J］.Curr Opin Infect Dis，2008，21(3):293-297.

［7］ Lapinsky SE.Epidemic viral pneumonia［J］.Curr Opin Infect Dis，2010，23(2):139-144.

［8］ Lee HW，Calisher C，Schmaljohn C.Manual of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome［M］.Seoul:Asian Institute for Life Sciences.1999:1-6.

［9］ 徐 海，王继春，于 辙，等.利用噬菌体随机肽库筛选可结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽序列［J］.微生物学报，2011，51(1):127-133.

［10］ Govarts C，Somers K，Stinissen P，et al.Frameshifting in the p6 cDNA phage display system［J］.Molecules，2010，15(12): 9380-9390.

［11］ Lin M，McRae H，Dan H，et al.High-resolution epitope mapping for monoclonal antibodies to the structural protein Erns of classical swine fever virus using peptide array and random peptide phage display approaches［J］.J Gen Virol，2010，91(Pt 12):2928-2940.

［12］ Gershoni JM，Roitburd-Berman A，Siman-Tov DD，et al.Epitope mapping:the first step in developing epitope-based vaccines［J］.Biodrugs，2007，21(3):145-156.

［13］ Ladner RC，Sato AK，Gorzelany J，et al.Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies［J］.Drug Discov Today，2004，9(12):525-529.

［14］ Benhar I.Biotechnological applications of phage and cell display［J］.Biotechnol Adv，2001，19(1):1-33.

［15］ 白雪帆，汪 毅，潘 蕾，等.汉滩病毒核衣壳蛋白主要B细胞表位的识别及其基因定位［J］.中华传染病杂志，1999，17(4):245-249.

［16］ 白雪帆，黄长形，汪 毅，等.应用噬菌体肽库技术对汉滩病毒核衣壳蛋白N端主要线性抗原位点的识别及其基因定位［J］.第四军医大学学报，1998，19(6):709-710.

［17］ 李光玉，白雪帆，潘 蕾，等.应用噬菌体展示随机肽库淘筛mAb 5H5识别的抗原表位［J］.中国病毒学，2001，16(4): 386-389.

［18］ Wang CJ，Tang JQ，Tao KH，et al.Screening and identification of mimic epitopes of monoclonal antibodies against hantaan virus using phage display technique［J］.Chin J Cell Mol Immunol，2004，20(4):429-432.

［19］ Bai XF，Fack F，Hang CS，et al.Construction of phage peptide library for hantaan virus nucleocapsid protein［J］.J Cell Mol Immuno1，1999，15(1):1-5.

［20］ 侯颖春，白雪帆，杨为松，等.出血热恢复期患者全套噬菌体抗体库的构建［J］.细胞与分子免疫学杂志，1997，13(4): 7-11.

［21］ Koch J，Liang M，Queitsch I，et al.Human recombinant neutralizing antibodies against hantaan virus G2 protein［J］.Virology，2003，308(1):64-73.

［22］ Jonsson CB，Milligan BG，Arterburn JB.Potential importance of error catastrophe to the development of antiviral strategies for hantaviruses［J］.Virus Res，2005，107(2):195-205.

［23］ Baneyx F，Schwartz DT.Selection and analysis of solid-binding peptides［J］.Curr Opin Biotechnol，2007，18(4):312-317.

［24］ Habich C，Kempe K，van der Zee R，et al.Heat shock protein 60:specific binding of lipopolysaccharide［J］.J Immunol，2005，174(3):1298-1305.

［25］ Wood KC，Azarin SM，Arap W，et al.Tumor-targeted gene delivery using molecularly engineered hybrid polymers functionalized with a tumor-homing peptide［J］.Bioconjug Chem，2008，19(2):403-405.

［26］ Daniels DA，Lane DP.Phage peptide libraries［J］.Methods，1996，9(3):494-507.

［27］ Larson RS，Brown DC，Ye C，et al.Peptide antagonists that inhibit Sin Nombre virus and hantaan virus entry through the beta3-integrin receptor［J］.J Virol，2005，79(12):7319-7326.

［28］ Hall PR，Malone L，Sillerud LO，et al.Characterization and NMR solution structure of a novel cyclic pentapeptide inhibitor of pathogenic hantaviruses［J］.Chem Biol Drug Des，2007，69 (3):180-190.

［29］ Hall PR，Hjelle B，Njus H，et al.Phage display selection of cyclic peptides that inhibit Andes virus infection［J］.J Virol，2009，83(17):8965-8969.

［30］ Song JW，Song KJ，Baek LJ，et al.In vivo characterization of the integrin beta3 as a receptor for Hantaan virus cellular entry［J］.Exp Mol Med，2005，37(2):121-127.

Application of phage display technology in Hantaan virus research

YANG Dong-qiangreviewing，BAI Xue-fanchecking
(Center of Infectious Diseases，Tangdu Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi＇an710038，Shaanxi，China)

Phage display is a new technique for the research of protein-protein or antigen-antibody interactions，new drug development，diagnosis of disease，vaccine design and virus research in recent years.This article reviews the current application of this technology in Hantaan virus research.

Phage display;Hantaan virus;Peptide

Q939.48

A

1008-8199(2012)07-0767-04

国家自然科学基金(30872215)

710038西安，第四军医大学唐都医院全军感染病中心［杨栋强(医学硕士研究生，现在河南省人民医院感染科工作)、白雪帆］

白雪帆，E－mail:xfbai@fmmu.edu.cn

2011-10-31;

2011-12-07)

(责任编辑:齐 名;英文编辑:郭联庆)