高效液相色谱法测定阿仑膦酸钠维生素D3片中维生素D3的含量及有关物质

周 华

（杭州民生药业有限公司，浙江 杭州310011）

阿仑膦酸钠维生素D3片用于防治和治疗各种骨质疏松症，如绝经后妇女的骨质疏松症、男性骨质疏松症。维生素D3可以提高肌体对钙的吸收，使血浆钙的水平达到饱和程度，促进生长和骨骼钙化，从而辅助阿仑膦酸钠治疗骨质疏松症。由于维生素D3对光、热不稳定，在空气中氧化和光解成前、反式维生素D3和速甾醇D3等多种产物，故我们选取制成包合物的维生素D3干粉为原料，再与其他药物制成复方制剂，以提高稳定性。由于制剂中维生素D3含量极低，且以包合物形式存在，故测定难度大。本文采用正相高效液相色谱法，可在同一色谱系统下测定制剂中维生素D3含量及其有关物质。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2487－1525－717液相色 谱 仪；Waters510－996 液相色谱仪；色谱柱：Aglient硅胶柱（ZORBAX RX－SIL，4.6mm×250mm，5μm）；岛津2550型紫外可见分光光度计；超声波发生器。

1.2 试药

阿仑膦酸钠维生素D3片（自制，每片含5 600IU，即0.14mg维生素D3，批号：20100830）；维D3干粉（10 000IU／g，DSM Nutritional Products Ltd.／瑞士，UT08120065）；维D3对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100061－200607）；对照样品（FOSAMAX Plus D，批号：Y3335）。异丙醇、异辛烷、正己烷、二甲基亚砜均为色谱纯，丁羟甲苯、正戊醇为分析纯，水为注射用水。

2 方法与结果

2.1 测定法

2.1.1 对照品贮备溶液的制备

精密称取维生素D3对照品25mg，置100mL棕色量瓶中，加异辛烷80mL，避免加热，用超声处理助溶1min使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，作为贮备溶液①；精密量取5.0mL至50mL棕色量瓶中，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作为贮备溶液②。

2.1.2 色谱条件与系统适用性试验

用硅胶为填充剂，正己烷－正戊醇（997∶3）为流动相，检测波长为264nm。量取维生素D3对照品贮备溶液①5mL，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1h，取出迅速冷却，加正己烷5mL，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254nm和365nm的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°，并距灯管5～6cm，照射5 min，使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3；取此溶液200μL注入液相色谱仪，测定维生素D3的峰值，先后进样5次，相对标准偏差应不大于2.0%；前维生素D3（与维生素D3的比保留时间约为0.5）与反式维生素D3（与维生素D3的比保留时间约为0.6）以及维生素D3与速甾醇D3（与维生素D3的比保留时间约为1.1）的峰分离度均应大于1.0。

2.1.3 响应因子测定

精密量取对照品贮备溶液②5mL，置50mL量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液；取200μL注入液相色谱仪，计算维生素D3的响应因子f1。f1＝C1／A1。式中：C1为维生素D3对照品溶液的浓度（μg／mL），A1为对照品溶液所得色谱图中维生素D3峰的峰面积。另精密量取对照品贮备溶液5mL置50mL量瓶中，加入2，6－二叔丁基对甲酚（BHT）结晶1粒，通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中加热1.5h，取出迅速冷却至室温，加正己烷至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液；取200μL注入液相色谱仪，计算前维生素D3的响应因子f2。f2＝（C2－f1A1）／A2，式中C2为f2测定项下维生素D3对照品溶液的浓度（μg／mL），f1为维生素D3的校正因子，A1为混合对照品溶液所得色谱图中维生素D3的峰值，A2为混合对照品溶液所得色谱图中前维生素D3的峰值。

取该制剂项下制备的供试品溶液进行测定，按下列公式计算维生素D3及前维生素D3折算成维生素D3后的总浓度 （Ci）。Ci＝f1Ai1＋f2Ai2，式中Ai1为维生素D3的峰值，Ai2为前维生素D3的峰值。

2.2 样品含量测定供试品溶液制备

避光操作。取阿仑膦酸钠维生素D3片粉约一片量（约含5 600单位VD3，0.14mg），精密称定，置于100mL棕色容量瓶中，加稀释剂（DMSO－水10∶2，0.02%BHT）50mL，超声10min（水浴温度不超过30℃），使维生素D3溶解，精密加入提取液（0.02%BHT的正己烷溶液）20mL，振摇15min，离心5min（5 000rpm），取上层清液作为供试品溶液。照含量测定法测定。

2.3 样品有关物质测定溶液制备

避光操作。取阿仑膦酸钠维生素D3片粉适量（约含32 000单位VD3，0.8mg）精密称定，置于100mL棕色容量瓶中，加稀释剂（DMSO－水10∶2，0.02%BHT）50mL，超声10min（水浴温度不超过30℃），使维生素D3溶解，精密加入提取液（0.02%BHT的正己烷溶液）20mL，振摇15min，离心5min（5 000rpm），取上层清液作为供试品溶液。取供试品溶液1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试品溶液和对照溶液各200μL，照测定法检测。

2.4 专属性试验

分别取维生素D3对照品、维生素D3干粉、空白辅料、阿仑膦酸钠维生素D3片粉，分别经过光照、高温、酸、碱、氧化破坏后，按照有关物质测定的方法处理并进样。同时分别取а－生育酚及干粉的其他辅料以及空白溶剂（DMSO－水10：2，0.02%BHT）50mL，按照有关物质测定的方法处理并进样。结果：保留时间4min以前的为溶剂峰及空白辅料峰，不干扰含量及有关物质的测定，可以扣除。维生素D3的降解产物与主峰完全分离，不干扰含量及有关物质的测定。检测出的最大杂质证明为辅料中引入的а－生育酚，含量远低于其产生生理活性的量，且与其他杂质峰完全分离，可用相对保留时间定位扣除。

2.5 线性及范围

分别精密量取对照品储备液适量，用正己烷稀释成维生素D3浓度为3.5、4.9、6.3、7、7.7、9.1、10.5μg／mL 的溶液，各溶液分别置自动进样器中自动进样（n＝3），记录维生素D3峰面积。峰面积均值X对进样浓度Y（μg／mL）线性回归，得回归方程为：A＝322354C＋5597.5，r＝0.9997。

2.6 回收率试验

取维生素D3干粉39、56、76mg（约相当于VD3为98、140、190μg）各3份，分别置于100mL棕色量瓶中，各加入1片量的空白辅料，加稀释剂（DMSO－水10∶2，0.02%BHT）50mL，超声10min（水浴温度不超过30℃），使维生素D3溶解，精密加入提取液（0.02%BHT的正己烷溶液）20mL，振摇15min，离心5min（5 000rpm），取上层清液作为供试品溶液。取供试品溶液，照测定法测定，即得。平均回收率为98.72%，RSD为1.10%（n＝9）。

2.8 仪器精密度

取一样品溶液置自动进样器中，连续进样5次，日内RSD为0.47%。

2.9 溶液稳定性

取一样品溶液置自动进样器中，分别于0、3、6.5、9.5、12.5、15.5、20h进样，RSD为1.70%。

2.10 样品含量测定及重复性试验

对同一样品（20100830）连续测定6次，求得含量为100.76%，RSD为1.20%。

2.11 样品有关物质测定

批号FOSAMAX Plus D Y3335，最大单杂为0.35%，杂质总量0.90；自制20100830，最大单杂为0.29%，杂质总量1.10。

3 讨论

维生素D3的正己烷溶液的紫外扫描图中的最大吸收峰为264nm，且主要杂质的最大吸收也在264nm附近，故选择264nm为含量测定和有关物质测定的检测波长。由于维生素D3干粉在生产过程中，外层包裹了明胶等水溶性的物质，本文采用的稀释剂（DMSO－水10∶2，0.02%BHT），能溶解包合材料及维生素D3，再用正己烷提取浓缩出来，以达到测定浓度的要求。而其他文献中采用皂化后提取测定的方法，操作不但繁琐，而且在皂化及提取中有部分损失，因而影响结果。本文的方法无须皂化，从而减少了处理过程中维生素D3的损耗，提高了测定的准确度，回收率高，辅料无干扰，同时具有简便、快捷的特点。本文样品溶液制备方法的摸索过程中，针对稀释剂中DMSO和水的比例、超声时间、提取液的体积、BHT的用量、振摇时间、离心时间及速度，均做了比较性试验，确定了最终的制备方法，提取回收率及方法回收率均较高。有关物质测定方法专属性较强，自制样品与进口对照样品测定结果接近。

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