诱导性多能干细胞技术的研究进展

李姝汶(综述)，郭红宇，王志平(审校)

(1.兰州大学第二临床医学院，兰州730107;2.兰州大学第二医院产科，兰州730107;3.兰州大学第二医院泌尿外科，兰州730107)

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)是通过在分化的体细胞中表达特定的几个转录因子，以诱导体细胞的重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞。由于其在研究疾病机制，药物筛选以及疾病治疗领域具有巨大的应用潜力，iPS技术的发现被列为“21世纪十大科技成就”之一，并迅速成为科学研究的新热点。

1 多能诱导干细胞技术的发展

1.1 转录因子的选择 2006年，Takahashi等［1］通过导入反转录病毒异位表达 Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4因子诱导鼠成纤维细胞转化为多能干细胞状态，第一次建立鼠类 iPS细胞系。此后，Yu等［2］和Takahashi等［3］也运用类似方法成功诱导人类iPS细胞。自此，iPS细胞技术在短短几年内就被广泛研究并获得了快速的发展。

最初研究者所使用的转录因子是Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，c-Myc的致癌性使这种技术应用于临床存在很高的风险。无c-Myc的iPS成功建系表明Myc基因在人和鼠的基因重组中并非必要，改进后重编程的效率大大降低［4-8］。2008 年，Kim 等［9］发现成鼠神经干细胞高表达内源性Sox2和 c-Myc，只需导入Oct4联合Klf4或c-Myc两个转录因子就可以成功诱导出小鼠iPS细胞，说明在诱导iPS细胞时，结合高表达的内源转录因子可以减少外源转录因子的使用数量，这大大降低了外源转录因子可能带来的风险。最近，Kim 等［10］首次证明了只使用一种转录因子Oct3/4即可成功诱导iPS细胞，但其效率很低。

1.2 载体的发展 重编程的诱导是将外源转录因子导入目的细胞，启动内源转录因子的表达，重编程的维持是依靠内源性因子。目前使用的载体主要为反转录病毒，而反转录病毒或慢病毒载体携带目的基因整合至宿主基因组能够确保重编程所需目的蛋白高效集中地表达，可能导致细胞产生插入突变或引发致癌基因的表达。因此，科学家也在积极开发无需整合的基因载体来诱导重编程，如腺病毒［11］和质粒［12］。

减少载体数量也能够降低整合造成的致癌概率。Carey等［13］用含有2A缩氨酸遗传代码的DNA将4种重组基因串联起来的方法获得了有能力表达多个基因的多顺反子性的慢病毒，将病毒载体数目从4个减少到1个，从而极大地简化了iPS的诱导。这项重要进展的推广面临着几个限制因素:①需要对蛋白进行多次复杂的提纯;②减慢了重组动力;③重组效率低。

1.3 iPS细胞技术派生方法学的发展 为了消除外源转录因子重新活化而带来的危险性，很多研究者尝试在外源转录基因发生基因沉默后将其从基因组中去除。Cre/LoxP重组体系能够成功切除已经转染的目标细胞内的整合基因，去除复杂的转座子是一个费力复杂的过程，即使成功了，这个策略也会留下导致载体序列发生突变的潜在后遗症［14］。近期有在鼠细胞中发现转基因无痕剪切的报道，这项技术应用了PB转座子系统，这项技术在人类细胞中的进展十分缓慢［15］。

近期有研究者在重编程过程中加入一些小分子干涉RNAs(siRNAs)或微小RNAs(miRNAs)，发现这些小分子能够取代一些重编程因子或提高重编程的速度和效率，可能产生更加安全的iPS细胞。Huangfu等［16-17］发现组氨酸脱乙酰酶抑制剂丙戊酸能够提高重组效率达100倍并能促进仅有Oct4和Sox2诱导的重编程。Zhao等［18］表明，p53 siRNAs大大提高了经典Yamanaka 4因子体系的诱导效率。Ichida等［19］最近发现一种小分子抑制剂转化生长因子β信号可以代替Sox2，诱使Nanog表达来启动重编程。iPS细胞中被上调的miRNA也可能对重编程有促进或抑制作用［20］。总之，以iPS细胞派生的方法学的迅速发展，改善了现有的iPS技术，这些分子水平基因重排的促进作用的具体机制仍不明确。

1.4 原始细胞的选择 早期研究者使用成纤维细胞进行重编程，近期其他研究小组也用其他来源于3种不同胚层的体细胞进行了尝试，包括B淋巴细胞、黑色素细胞、角蛋白细胞、间质细胞、外周血细胞、脂肪干细胞等［9，21-24］。

Kim等［25］报道了人胎儿神经干细胞能够只用Oct4因子就能实现重编程。鉴于获取这种细胞需要侵入性的手术，目前不能作为诱导iPS细胞的稳定来源。神经干细胞可以作为更好且更加简便的平台来获取iPS细胞以及动物疾病模型，这为研究iPS细胞移植、人类疾病机制以及药物研发都提供了很好的工具。

Utikal等［26］利用人初级黑色素细胞作为起始细胞进行重编程，正如皮肤成纤维细胞和角质细胞一样，黑色素细胞也是在特殊条件下经皮肤活检组织培养体外而来。这种细胞有高水平的Sox2因子表达，因此只需要另外3种因子(Oct4、Klf4、c-MYC)来诱导重编程，因为该研究所用的黑色素细胞的供体年龄并不明确，因此关于成人的黑色素细胞重编程的效率和速度并不清楚。尽管如此，利用黑色素细胞通过较少的细胞因子以及非集成化的技术为提高获得iPS细胞的安全性提供了一个很好的机会。

近期有两篇文章报道了利用脐带血细胞成功诱导iPS细胞。Giorgetti等［27］仅利用Oct4和Sox2两种转录因子将从脐带血细胞中分离的CD133+细胞诱导成iPS细胞，利用低温冷藏了5年的脐带血所分离的细胞也诱导成功。Haase等［28］利用脐带血来源的内皮细胞外加 Thomson 4因子(Oct4、Sox2、Nanog、Lin28)诱导出iPS细胞。脐带血含有包括造血干细胞在内的许多不同种类的细胞，因此要用脐带血细胞作为iPS细胞的来源就需要患者出生时储存脐带血。目前科学界不明确脐带血究竟能冻存多久还能保持其重编程的能力，所以这项技术应用前应对冻存了几十年的脐带血进行重编程能力测定。

靶细胞不同，重组的概率就不同，如造血干细胞重组效率高于末端分化的B细胞和T细胞［29］。不同来源的细胞具有不同的分化性质。一项研究发现来自肝细胞的iPS细胞更倾向于分化为畸胎瘤而非神经元细胞及其前体［30］。总之，不同类型细胞的重组效率、动力学和重组分化潜能都有很大差别，实际应用可能导致疗效的差异。

2 多能诱导干细胞在医学研究领域中的新进展

iPS细胞与胚胎干细胞在基因表达、DNA甲基化、胚状体、活嵌合体方面都完全相同，具有生成所有胚层细胞并继续分化为多种成体细胞的能力。因此，这项技术最有潜力的应用前景是产生疾病或个体特异的多能干细胞，用于研究组织功能、筛选新药和移植治疗遗传或退行性疾病。

目前疾病特异性iPS细胞的培养也已经在其他十余种基因疾病中实现，包括帕金森病、1型糖尿病、肌营养不良症、腺苷脱氨酶缺乏有关严重联合免疫缺陷、Gaucher病Ⅲ型、亨廷顿舞蹈症、唐氏综合征、自毁容貌症［31］。这些细胞系不仅可以作为外模型用来研究相应疾病，同时也可以作为细胞替换疗法的一种潜在的细胞来源。

2.1 血液遗传病 2009年，Ye等［32］用包含4个转录因子基因(Oct4、Sox2、Klf4、cMyc)的反转录病毒载体转染β珠蛋白障碍性贫血患者的皮肤诱导成纤维细胞重编程为iPS，发现这些iPS细胞可以分化成造血干细胞并进一步生成血细胞，表明使用iPS技术进行早期细胞治疗能够为珠蛋白生成障碍性贫血胎儿围生期治疗提供新的方法。

2.2 肝脏疾病 研究发现成纤维细胞来源的iPS细胞可以恢复酵素水解酶缺陷型小鼠的肝功能，证明了iPS细胞分化而来的肝细胞不仅能够重新回到肝脏，且可修复肝功能的损坏［31］。这项研究加深了研究者对体内情况下iPS细胞分化为肝细胞潜力的了解以及用患者肝细胞建立体外疾病模型的应用。

2.3 心血管疾病 另有实验表明iPS细胞可以分化为组成心血管的主要细胞类型，包括平滑肌细胞、内皮细胞、血管壁细胞以及心肌细胞［33-35］。通过人的胚胎干细胞和iPS细胞分化而来的心肌细胞已被用于药物毒性测试，如药物引起Q-T间期延长导致的突发性心跳停止，而这恰好是制药公司最为关注的安全问题［36］。

2.4 神经退行性疾病 Dimos等［37］成功地从一个患有家族肌萎缩侧索硬化症且伴有超氧化物歧化酶1变异的老年患者身上获取体细胞并诱导成iPS细胞，这些iPS细胞分化为带有典型标志物Hb9和胰岛素基因增强结合蛋白1的运动神经元细胞。虽然脊髓性肌萎缩症和肌萎缩侧索硬化症都属于运动神经元神经退行性疾病，但只有脊髓性肌萎缩症患者的iPS细胞所分化而成的运动神经元有相应症状。这可能是因为肌萎缩侧索硬化症基本都是中年以后发病，而脊髓性肌萎缩症基本都是儿童期发病。此外，也可能是由于神经退行性疾病模型所采用的iPS细胞是来自于具有常染色体隐性遗传脊髓性肌萎缩症和家族性自主神经异常的患者。

2010年，Amoh等［38］研究发现毛囊诱导干细胞可以形成神经元和其他细胞类型，移植的毛囊干细胞促进周围神经功能恢复和脊髓受伤，因此成人毛囊干细胞的治疗应用尤其是对神经系统疾病的治疗，有了潜在的临床实用性。这些研究为神经退行性疾病机制以及药物的研发开辟了新的道路。

3 问题与展望

由于iPS细胞自身的特性，既可用于研究组织功能和筛选新药，也可用于移植治疗遗传或退行性疾病，不仅避免了免疫排斥及伦理问题，还可以产生新的治疗方法。iPS细胞技术应用在临床实践前，仍然面临着一些重要的挑战:①iPS细胞诱导方法仍存在诸多不足，尚待改进。以经典的反转录病毒介导重排的人类iPS细胞生成效率低，仅有0.001%～0.01%;用于重组病毒载体的重组基因是已知的致癌基因，特别是c-Myc、Oct4和Klf4产生的iPS细胞不可能安全地被用于临床。一些新技术的发展，包括无病毒整合的重组质粒或直接重组等蛋白质技术以及化学或包括蛋白在内的小分子诱导的办法，就有可能解决这些问题。②iPS细胞自身安全性有待提高，尚未达到“临床级别”。同其他来源的干细胞一样，iPS细胞自身也具有潜在危险性，如畸胎瘤的形成、异常重编程等。因此，iPS细胞的任何临床试验和治疗应用前应首先确定统一的鉴定iPS安全性的标准，并在适当的动物模型上经过严格的测试。③未来进行患者自体特异性iPS细胞的生产以及临床治疗时要慎重考虑选择哪一种类型的细胞进行重编程。从患者身上分离进行重编程的理想的细胞来源应符合以下标准:容易取得且手术风险小;获取量要足够大;拥有较高的重编程效率;重编程后的iPS细胞具有较快的分裂速度。为确保iPS细胞技术在临床前研究及临床应用，还应开发体内追踪细胞命运轨迹的新技术，以探索iPS细胞的疗效及后期影响。④在伦理方面。iPS细胞虽然避免了从人类胎盘获取的争议，但是并不代表在道德层面不受质疑。iPS细胞可以从活体捐赠者身体组织中取得，对捐赠者的跟踪接触可能接触到道德和法律底线，用这种方式研究取得成果的发表也可能触犯捐赠者的健康和权利。

尽管利用iPS细胞技术应用于临床治疗面临着很多困难，一旦实现可行、安全、高效、无病毒、无转基因的自体iPS细胞技术这一研究领域的最终目标，必将给医学研究及多种疾病治疗带来深远的影响。

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