葛夏青(综述),孙喜太(审校)
(1.东南大学医学院,南京210009;2.南京市鼓楼医院肝胆外科,南京210008)
肿瘤的生长、侵袭以及转移都具有血管依赖性[1]。最初对肿瘤血管的研究聚焦在肿瘤诱发的血管新生,即在原有血管基础上向肿瘤组织方向以出芽方式形成血管的过程。然而,进一步的研究发现一种新的血管生成机制,即所谓的血管生成,它是指由骨髓分化而来的原始细胞,即内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),从骨髓释放并归巢至肿瘤血管新生位点参与血管新生的过程[2]。Asahara 等[3]于 1997年首先用免疫磁珠从外周血中分离出CD34+/血管内皮细胞生长因子受体2+血管EPCs,它是内皮细胞的前体细胞,具有向内皮细胞分化的潜能,并参与肿瘤血管新生。随后,大量研究证实骨髓来源的EPCs参与肿瘤新生血管的形成。近几年来,关于此方面大量的人和动物的研究使人们更加深入地理解了EPCs在肿瘤血管发生过程中的作用[4]。基因治疗是指将有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的目的[5]。在基因治疗过程中,为使基因能定向传递到特定的靶细胞中,就必须有一个合适的靶向转移载体系统。EPCs能够靶向性聚集到肿瘤部位和缺血损伤部位的特性受到人们的关注。相关研究支持EPCs能够作为靶向载体的假说[6]。EPCs有靶向性高,系统毒性低的特点,有望成为肿瘤及其他方面基因治疗的理想载体。
胚胎第15天左右卵黄囊出现扁平状的细胞,为早期的EPCs,参与胚胎期血管发生,出生后EPCs定居于骨髓组织,机体需要时能在粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子及血管内皮生长因子等细胞因子的作用下,从骨髓中动员到外周循环归巢,到缺血组织参与血管新生[7]。
Asahara等[3]在1997年第1个描述了成体外周血中骨髓来源的EPCs。目前没有在体外分离培养EPCs的标准程序[8]。最普遍采用的是将骨髓或外周血经淋巴细胞分离液分离后,直接或再通过磁珠分选后的细胞放入经明胶或胶原裱衬的培养瓶中,培养液为添加胎牛血清、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子b、表皮细胞生长因子的培养基。不同培养时间的EPCs可能呈椭圆形、长梭形、纺锤形,在形态上无法与其他细胞区分开来,主要靠细胞表面标志来识别。EPCs细胞表面的标志有CD34、CD133(AC133)、c-Kit、Sca-1、DiIAc-LDL、vWF、血管内皮细胞生长因子受体2(KDR,Flk-1)。但是,由于干/祖细胞标志CD133、CD34或血管内皮细胞生长因子受体2既能在EPCs上,也能在造血干细胞上找到,血管内皮钙黏蛋白或内皮细胞选择素是内皮系特殊标记,但也出现在一部分EPCs上,因此EPCs包括处于从造血-血管祖细胞到分化内皮细胞,目前并没有发现唯一能将EPCs同其他的细胞严格区分的表面标志。目前将同时具有CD34、AC133、血管内皮细胞生长因子受体2三种表面标志的细胞称为EPCs[9]。
EPCs是指在血管新生部位能够分化形成功能血管的循环系统的内皮前体细胞。
血管新生包括两种形式:一种称为血管新生,由原先存在的血管内皮以出芽、分裂增殖等方式形成毛细血管丛,这一过程在实现由较大的血管网分支形成较小的血管丛在提供发育器官的血供方面起到十分重要的作用[10];另一种称为血管生成,由循环系统内或驻留在组织内的成血管细胞或EPCs形成新血管结构的过程。在胚胎发育期,血管的血管生成和血管新生同时产生作用,但出生后,人们一直认为血管的形成、维持和修复的机制是血管新生[11]。
1997年,Asahara等[3]在外周血CD34+细胞中分离出EPCs,进一步的研究发现在出生后骨髓来源EPCs能够参与血管的新生,能够在以前未存在血管的地方形成血管和血细胞,即出生后的血管发生,从而改变了以前对血管新生的认识。
20世纪70年代初,Folkman[12]首先提出“肿瘤生长和转移都依赖于新生血管的形成”。与胚胎发育期类似,血管的形成对于恶性肿瘤的发展起着决定性作用。大多数肿瘤组织起初以无血管的方式生长,直到其增殖和凋亡速率达到平衡,维持在封闭的休眠状态。而肿瘤一旦从休眠期苏醒,就变得高度依赖养料以生长达到一定大小。肿瘤细胞通过过度表达促血管生长因子,促进更多的异常血管生长的方式来克服缺氧的状态[10]。
Lyden等[13]对独特型基因突变型小鼠(Id-突变体小鼠)进行研究,这种小鼠因血管生成受损不能产生新的肿瘤血管而导致移植的肿瘤迅速缩小。将野生型小鼠骨髓移植到Id-突变体小鼠体内后将恢复小鼠的肿瘤血管生成能力,并促进肿瘤生长,这一研究首次证实骨髓来源的EPCs参与肿瘤血管生成。实验发现,众多肿瘤均可以利用EPCs形成新的血管[14]。
临床研究显示,在侵袭性肿瘤[15]和复发性肿瘤[16]患者外周血中频繁检测到EPCs的存在,提示EPCs参与肿瘤的发生。在一项对53例非小细胞肺癌患者的研究中发现,癌症患者的循环EPCs量的基准水平显著高于健康人。另外,还发现循环EPCs水平的增高与生存率的下降相关[17]。临床相关性研究报道,循环系统中EPCs的增加与乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌患者的肿瘤分期及肿瘤大小呈正相关[15,18-19]。EPCs引起的血管新生的效应是由多方面因素决定的,如肿瘤的分期、位置以及类型[20]。有研究证据表明,在接受贝伐单抗治疗的直肠癌的患者中,可将循环系统EPCs作为反映血管新生活动的预测指标[21]。循环系统的EPCs似乎伴随着肿瘤活化信号的出现而同时出现[22]。现在对EPCs与肿瘤血管新生间关系的研究认为,在肿瘤的无血管期中,缺血组织由于缺氧诱导了EPCs的聚集[23],EPCs在体内能定向归巢于肿瘤,参与肿瘤新生血管的建立[24]。
基因治疗载体大致可分为病毒型载体和非病毒载体。在过去的20年里,使用病毒载体和非病毒载体施行了1500多个基因治疗的临床试验。然而,在大多数的例子中,治疗的效果并不满意,不良反应成为人们关注的主要问题[25]。
病毒型载体系统在体内外实验中使用较多,主要有反转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体等,但病毒型载体缺点在于潜在的致癌性、自身免疫原性和(或)造成细胞病理改变等[26]。Ehlert等[27]在行腺相关病毒介导短发夹RNA的针对神经细胞基因治疗中发现,当短发夹RNA在中枢神经系统高表达时,会引发不良反应导致神经退化。
非病毒载体系统所面临的共同问题是外源基因转移到宿主细胞后表达时间短,且基因表达关闭的机制尚不明确。
研究发现[28],EPCs不表达主要组织相容性复合体,没有免疫排斥作用,在体内能够躲避自然杀伤细胞的杀伤作用,且其有靶向性高,系统毒性低的特点。临床研究证实,EPCs能够定向归巢于肿瘤组织[18],利用此特性可将其作为靶向运输至肿瘤组织的基因载体[23]。由于EPCs具有维持成人血管完整性的生理功能,EPCs不仅可以定向聚集在肿瘤部位,同时也在缺血组织血管再生方面起到作用[29]。
4.1 EPCs与肿瘤的基因治疗 2008年,王鈜等[30]将人干扰素γ基因经腺病毒转导入EPCs,给荷瘤裸鼠静脉注射携带干扰素γ基因的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells carrying hIFN-γ,EPCs-hIFN-γ),研究表明EPCs-hIFN-γ可以靶向性地分布到肿瘤局部,通过肿瘤局部分泌的干扰素抑制肿瘤的生长,延长荷瘤裸鼠的生存时间。
2010年,Hamanishi等[31]通过反转录病毒将鼠CC趋化因子配合基19(CC chemokine ligand 19,CCL19)基因导入胚胎内皮祖细胞(embryonic endothelial progenitor cells,eEPCs),此基因表达后可产生一种淋巴细胞迁移趋化因子。在B6C3F1型小鼠皮下接种鼠卵巢癌HM-1型细胞,配合小鼠体内注入导入CCL19基因的eEPCs,研究结果显示出免疫活性和肿瘤抑制效应。与对照组相比,eEPCs-CCL19组荷瘤小鼠体内肿瘤渗入更多的CD8+淋巴细胞,显示出肿瘤抑制效应。在后续的研究中,该小组通过尾静脉注入HM-1型细胞、B16黑素瘤细胞建立肺转移癌模型,紧接着注入导入CCL19的EPCs而减少了肺转移癌的数量并延长了小鼠的生存时间。在使用HM-1型细胞建立的肿瘤模型中,用此方法同样可以观察到抗肿瘤效应。这项研究结果显示,使用EPCs传递系统免疫活化信号可改变肿瘤免疫微环境并起到治疗作用,这对于多发的转移的恶性肿瘤来说提供了一种新的治疗策略。
王鈜等[32]在细胞毒性化疗药物作用后的裸鼠结肠癌移植瘤模型中给予EPCs-hIFN-γ,研究表明EPCs-hIFN-γ用于化疗后维持治疗可以抑制肿瘤细胞生长,延长荷瘤小鼠的生存期。上述实验表明,EPCs可以靶向性的分布到肿瘤局部,可以作为免疫性基因载体在肿瘤治疗领域进行进一步的研究。
Zhang等[33]将胸苷激酶基因修饰的EPCs注入带有神经胶质瘤的裸鼠体内,配合更昔洛韦治疗后,通过细胞凋亡及微血管密度的分析来评估其抗肿瘤效应。研究结果显示,配合更昔洛韦治疗后,胸苷激酶基因修饰的EPCs对神经胶质瘤细胞和人脐静脉内皮细胞显示出潜在的旁观者效应。研究显示,通过多次静脉注入胸苷激酶基因修饰的EPCs可抑制血管生成而产生抗肿瘤效应。
2012年,Varma等[34]在人神经胶质瘤小鼠模型内利用EPCs作为载体于肿瘤部位基因表达人钠碘同向转运体,并通过单光子发射计算机断层成像术检测到了EPCs的迁移及人钠碘同向转运体基因的表达。研究表明EPCs能够作为基因载体对神经胶质瘤进行基因治疗。
4.2 EPCs与心血管的基因治疗 2009年,Song等[35]将肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)导入EPCs,将HGF-EPCs注入高胆固醇血症引起的动脉损伤小鼠模型,研究显示HGF组小鼠体内靶向到达血管损伤部位的EPCs数量明显高于未导入HGF基因的小鼠。更进一步研究表明,系统地采用HGF-EPCs可以更有效地减少新生血管内膜的形成,增加血管内皮新生。研究表明,EPCs作为基因载体是一种预防血管损伤后内膜形成的实用而有前途的治疗方法。
Chen等[36]从猪外周血中分离培养EPCs,通过腺相关病毒将包含信号肽的成纤维细胞生长因子1(signal peptide-containing version of the FGF1,sp-FGF1)基因转导入EPCs,在体外,转导sp-FGF1基因的EPCs在迁移、管样物形成及生存方面的能力增强。在动物心肌缺血模型中,经过4周的细胞移植治疗,通过单光子发射计算机断层成像术评估与对照组相比,转导sp-FGF1基因组的动物在心肌灌注的缺损显著减少,心肌缺血部位血管密度显著增加。研究表明在慢性缺血模型中,基因改造后的EPCs血管生成能力比改造前得到提升,预示可用基于细胞的基因治疗策略来治疗缺血性疾病。2011年,Chen等[37]在猪模型中,通过腺病毒将血管内皮生长因子基因修饰到EPCs上,并种植到膀胱非细胞基质移植物,通过观察微血管密度来判断血管生长情况。研究发现,基因修饰组的模型的移植物血管密度显著高于对照组。此项研究表明,在膀胱组织工程学方面,基因修饰血管内皮生长因子的EPCs可作为增加血供的良好手段。
EPCs可以作为很好的组织工程及基因治疗的载体,因为它们有良好的分型、广泛的分化潜能以及有效的基因转导能力[38]。EPCs不表达主要组织相容性复合体,没有免疫排斥作用,能够躲避自然杀伤细胞的杀伤作用,因此EPCs在肿瘤靶向生物治疗中具有良好的运用前景。但在EPCs研究方面仍然存在问题需要克服,如EPCs在外周血中数量少,缺乏特异的分子标志,外周血EPCs是否可以替代生物标志物用作监测抗肿瘤、抗新生血管生成的药物疗效等。尽管一些关于EPCs的小规模、非随机、非对照实验已经出现,但是要深刻理解的生物学特性、评估这种新颖治疗方法的安全性和临床潜能以及加速基础研究向临床应用治疗肿瘤方面的转化还有很长的路要走[20]。相信,EPCs会成为肿瘤基因治疗的一个有潜力的新靶点,为临床治疗肿瘤提供一条全新的途径。
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