树突状细胞的研究进展

冯钟煦(综述)，刘剑勇(审校)

(广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科，南宁530021)

树突状细胞(dendritic cells，DC)是目前人体内最活跃，功能最强大的专职抗原呈递细胞，是人体对免疫原产生免疫应答的重要细胞之一。DC广泛存在于血液、淋巴、肝脾及皮肤黏膜等组织，能激活功能性淋巴细胞，并产生细胞毒作用，提高机体免疫水平。DC对抗原和弱抗原都有很高的呈递效率，只需少量的抗原及DC即可激活T细胞，因此成为抗肿瘤和抗病毒免疫研究中的热点。

1 DC的来源与分化发育

DC的产生分两个阶段:从祖细胞分化为未成熟DC和未成熟DC受外界刺激(如细菌产物、坏死物及及各种细胞因子)分化成熟。

1.1 DC的分化 体内DC起源于多能造血干细胞，按来源其分化途径分为两条:①髓系分化途径。称为髓系DC(myebiod，DC1)，最终分化为朗格汉斯细胞和间质DC两个亚群。DC1由髓样干细胞在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、肿瘤坏死因子α刺激下诱生为DC。亦有来源于外周血单核细胞，也称为DC1前体细胞，在GM-CSF、白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)作用下或穿越内皮细胞并吞噬异物后分化为DC。②淋巴系分化途径。为淋巴系DC(lymphoid，DC2)，最终分化为类浆细胞DC。DC2的前体细胞不表达髓系抗原，也无吞噬、吞饮抗原能力，低表达GM-CSF，高表达 I L-3受体，在IL-3刺激下分化为DC2。目前对DC亚群及分化的研究主要来源于体外培养的方法，体内天然DC亚群的分类仍有待于进一步研究［1］。

1.2 DC的表型变化 DC的发育分为成熟与未成熟阶段，两者具有不同的生物学特征和细胞表型［2］。正常情况下，体内多数DC处于未成熟阶段，其广泛分布于全身各外周组织，高表达吞噬相关受体(Fc受体、补体受体、甘露糖受体)，而不表达或低表达共刺激分子和黏附分子(CD14、CD54、CD40、CD80)。未成熟DC有较强的抗原内吞和加工处理能力，而激发混合淋巴细胞反应能力较弱。经过抗原摄取、炎性因子活化等一系列过程，DC由未成熟转变为成熟，成熟DC则高表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子和CD54、CD40、CD80、CD86等共刺激分子和黏附分子，CD83、CD25为成熟DC的特征性标志。成熟DC的抗原呈递能力及体外激发混合淋巴细胞反应的能力强，而抗原摄取能力弱。DC的成熟过程同时伴有迁徙，在外周组织中摄取抗原后，通过延长树突状突起，改变趋化因子受体表达等方式进入淋巴结及淋巴管中成熟，并激发T细胞反应。

2 DC在免疫应答中的作用

2.1 外源性抗原的摄取与加工 未成熟DC具有极强的内吞能力，通过膜皱缩和形成大囊泡，形成液相内吞作用，可使极低浓度(10～10 mol/L)抗原得到呈递，也可通过受体介导对糖基化抗原进行内吞。被DC摄取的抗原分子经过MHCⅡ类途径处理、加工成为抗原多肽，再以MHCⅡ类分子/肽复合物形式呈递在DC表面，并可以维持较长时间(24～48 h)的免疫激发功能。未成熟DC对吞饮速度快，吞饮量大，是体内抗原的主要摄取者［3］。

2.2 DC在免疫激活的作用 摄取抗原后的DC逐渐成熟并表现出很强的免疫激活能力。在与T细胞的互动中，除提供MHCⅡ类分子/肽复合物的第一信号外，还高表达B7-1、B7-2、CD40分子，为T细胞提供充足第二信号，来促进T细胞的激活。实验证明，DC还可参与B细胞的生长、分化与抗体生成。通过诱导T细胞生成B细胞刺激因子，作用于B细胞，使其分泌IgG、IgA、IgM［4］。

2.3 诱导自身免疫耐受 DC是体内唯一能激活静息型T细胞产生初次免疫应答的细胞，并且能通过点状放大刺激，激活T细胞增殖［5］。因此，在诱导T细胞活化或耐受过程中，DC发挥着十分重要的作用。未成熟DC诱导免疫激活的能力较弱。有学者推测，未成熟DC很可能在免疫耐受的产生中发挥了重要作用，目前无直接证据支持这一理论。有观点认为DC的不同成熟状态有着不同的功能，DC的不同成熟状态不仅决定T细胞的激活程度，而且决定T细胞的反应类型［6］。存在于非淋巴组织中(如肝、肾、皮肤、血液等)的DC是一群未成熟DC，具有极强的摄取、处理和一定的呈递抗原能力。由于缺乏B7等共刺激分子，不能活化T细胞，反而使T细胞功能失活，诱导T细胞耐受，被认为是“耐受性DC”。

3 DC抗肿瘤免疫机制

人体的抗肿瘤免疫流程:①肿瘤相关抗原的摄取与呈递;②激活肿瘤相关抗原特异性T细胞;③引导肿瘤相关抗原特异性T细胞至肿瘤部位，杀灭肿瘤细胞。机体抗肿瘤免疫主要依靠细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的免疫应答来杀伤肿瘤细胞，CTL并不能识别完整的肿瘤抗原分子，只能特异性地识别来源于肿瘤抗原亲本、由MHC分子呈递的抗原多肽。在大部分恶性肿瘤中，肿瘤细胞表面的MHC抗原肽、共刺激分子和黏附分子表达较低，不能有效地诱导T细胞活化，故需要抗原呈递细胞的协同作用［7-8］。

作为体内抗原呈递能力最强的专职抗原呈递细胞，DC在抗肿瘤免疫中起到“中枢性”的作用，其作用的发挥依赖于以下环节:DC浸润入肿瘤组织;DC对肿瘤抗原的摄取、加工和呈递;DC的活化以及迁移进入次级淋巴器官诱导T细胞活化。除诱导细胞免疫外，DC还可以增强体液免疫:一方面，DC通过促进抗原特异性CD4+Th的产生，促进抗体生成;另一方面，DC直接作用于B细胞，促进免疫球蛋白的分泌。淋巴系DC中的类浆细胞可分泌Ⅰ型干扰素，直接诱导初始和记忆B细胞分化为浆细胞，产生大量免疫球蛋白IgM［9］。

DC可以通过与某些肿瘤细胞相互接触，直接抑制肿瘤细胞的生长［10］。肿瘤抗原致敏的DC可释放一种具有抗原呈递能力的囊泡小体exosomes，该小体内含有大量MHCⅠ、Ⅱ类分子和共刺激分子，能显著刺激抗原特异性CD8+T细胞增殖，并诱导抗原特异性CTL反应［11］。

研究表明，在肿瘤患者体内，DC的数量下降，功能也受到了不同程度的抑制，不能有效摄取、处理、呈递肿瘤抗原，使机体的免疫反应处于抑制状态，从而导致肿瘤的发生、发展。另外，DC浸润、迁移和活化的局部微环境的变化，导致DC不能进入肿瘤组织，不能有效地识别肿瘤提供的“危险”信号。DC迁出肿瘤组织困难，会抑制DC表型和功能的成熟进程，从而抑制免疫反应的产生。肿瘤局部DC的数量和功能状态与肿瘤进展部的预后明显相关［12］，因此通过人为方法保证DC的高效运作成为肿瘤免疫治疗的有效途径。

4 DC的培养和DC疫苗的制备

正常人体内DC数量少，不能满足科研和临床的需要。体外诱导培养DC技术的进步使DC疫苗抗肿瘤治疗成为可能。

4.1 DC的培养 目前用于治疗的DC多来自骨髓或外周血CD34+造血祖细胞、外周血DC及单核细胞，其中以单核细胞来源的DC应用最广。获取DC的方法有:①将来源于骨髓或外周血CD34+造血祖细胞在体外与GM-CSF和肿瘤坏死因子α共同培养，获得大量DC［13］。②单核细胞在GM-CSF和IL-4共同作用下诱导分化为未成熟DC，并在外来因素刺激下进一步分化为成熟DC［14］。③Flt3配体能动员DC进入外周血，显著增加外周血中DC的数量，进而直接从外周血中分离纯化到大量DC［15］。

另外，有研究使用脐血来源的单个核细胞制备DC［16］，即用脐血单个核细胞，在GM-CSF、IL-4和脐血中的细胞因子作用下分化成未成熟DC。该实验用脐血浆取代肿瘤坏死因子α在较短时间内促进脐血单个核细胞分化成DC，充分利用脐血中富含的细胞因子，减少了重组细胞因子的用量，提供了一个由脐带血制备DC的相对简单、高效的途径。

4.2 肿瘤抗原负载DC的方法

4.2.1 多肽类抗原负载DC 用肿瘤已知的特异性多肽物质作为抗原负载物，靶向性较好，可避免自身免疫反应的发生，较安全。庄志祥等［17］用前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原与前列腺酸性磷酸酶多肽联合致敏自体DC治疗激素难治性前列腺癌，结果明显改善了患者免疫功能，有效激发了特异性T细胞免疫应答，病情得到控制和缓解。

4.2.2 肿瘤细胞成分负载DC 用完整肿瘤细胞作为抗原负载DC，不需要分离鉴定肿瘤抗原，且有多种抗原表位供识别。具体应用可采用肿瘤细胞裂解物、凋亡的肿瘤细胞及肿瘤mRNA来负载，也有用电融合技术将DC与肿瘤细胞融合［18］。以上负载物各具特点:①肿瘤细胞裂解物刺激DC，可有明显的抗肿瘤效应［19］，但需要肿瘤组织多，且抗原繁多不可控，有激发自身免疫性疾病的危险。②凋亡的肿瘤细胞或凋亡的肿瘤抗原比肿瘤裂解物有更高的负载效率。李旭奎等［20］应用SACC283癌细胞凋亡抗原体外冲击致敏的方法负载DC，并成功在体外诱导淋巴细胞介导的抗腺样囊性癌细胞的免疫反应，证实了凋亡抗原负载DC的有效性。③肿瘤的mRNA可通过扩增技术从有限的标本得到足量的mRNA，同时可极大地避免自身抗原的混杂，防止自身免疫反应的发生。也有直接用肿瘤细胞与DC融合，所得肿瘤疫苗不仅具有完整的肿瘤抗原，而且具有呈递细胞的特性，能够有效呈递肿瘤抗原给T淋巴细胞，从而激发机体产生特异性的抗肿瘤免疫应答。

4.2.3 抗原基因导入DC 将肿瘤抗原的基因导入DC，让肿瘤抗原在DC内表达，进而有效激活T细胞。导入的方法主要是采用病毒载体，包括反转录病毒、腺病毒等。有研究证实，携带目的基因的重组病毒转染的DC疫苗诱导CTL能力高于抗原肽或全抗原负载的DC［21］。其原因可能为转染后抗原的表达在DC内部，内源性抗原更有利于DC对抗原的加工。虽然病毒壳蛋白可作为免疫原刺激DC活化，导致病毒特异性免疫应答产生，但病毒与宿主细胞有整合的危险，该方法尚待完善。

4.2.4 细胞因子基因导入DC DC的生长需要多种细胞因子刺激完成。负载抗原刺激DC分泌的IL-2、IL-12、肿瘤坏死因子α等细胞因子可延长DC及其诱导的CTL的寿命。向DC导入细胞因子或趋化因子的基因，可增强其抗肿瘤效应。曹大勇等［22］以反复冻融的肝癌细胞冲击致敏IL-2基因修饰的DC，诱导出较肝癌细胞致敏DC更高水平的CTL。

5 DC疫苗治疗肿瘤的研究进展与前景

从1996年首次报道DC疫苗应用于临床免疫治疗到现在，DC疫苗已经在恶性淋巴瘤、恶性黑素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等恶性肿瘤的临床治疗中取得了较好的疗效［22］。2002年DC疫苗作为肿瘤生物治疗的方案通过美国食品药品管理局批准，正式进入临床试验，DC疫苗的研究也展现了极好的发展和临床应用前景。在我国肝癌发病率呈缓慢上升趋势，病死率也随之上升，占癌症病死率的第三位，发展DC疫苗抗肝癌治疗的研究具有较高的临床价值。Palmer等［23］报道了 DC疫苗的Ⅱ期临床试验，对35例不适合手术的晚期肝癌患者每间隔3周注射DC疫苗，其中25例患者至少接受3次注射后评估其临床反应。结果显示，影像学控制率为28%，甲胎蛋白＞1000 μg/L的17例患者中有4例甲胎蛋白下降＞10%，证明了同源DC疫苗的安全性和有效性。肝癌属于实质性肿瘤，局部免疫治疗在生存期、复发率和不良反应等方面均好于系统免疫治疗。DC瘤苗单独治疗使用很难取得理想的抗肿瘤效果，往往需要与手术、放疗、化疗的联合应用，而与免疫刺激剂联合应用也是常用方法。王志明等［24］采用肿瘤裂解抗原致敏的DC疫苗局部瘤内注射联合应用非甲基化CpG-ODN，明显抑制小鼠H22肿瘤的生长，说明DC疫苗对H22肿瘤有抑制作用，同时也显示出联合非甲基化CpG-ODN瘤内注射可进一步提高局部抗肿瘤生长作用。

大多数研究均能够检测到由DC瘤苗所致的抗肿瘤免疫反应，提示负载有肿瘤抗原的DC在体内是能够表达和增强肿瘤的免疫原性，进而增强淋巴细胞的抗肿瘤作用。当然，要使DC肿瘤疫苗在临床上广泛应用，还存在各种各样的问题，如制备的最优方法以及接种的最佳程序还存在争议;DC疫苗长期作用中有可能会诱发机体的自身免疫反应的风险;活化的T细胞不能完全渗透入肿瘤或不明原因的失活以及疫苗使用剂量、免疫频率、疗效评价等问题有待于进一步研究解决。相信随着科研的深入及医疗技术的不断完善，DC疫苗抗肿瘤治疗会有更大的应用前景。

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