DPP-4抑制剂的构效关系

陈忻 翟所迪

据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，简称IDF）统计，在2000年全球有糖尿病患者1.51亿，到2010年11月全球糖尿病患者已超过3亿，还有3亿人属于糖尿病的高危人群，而且正以每年新发700万患者的速度迅速蔓延[1]。我国属于糖尿病易感人群国家，目前我国糖尿病患者数量占据全球的1/3，2008年的调查结果显示，在20岁以上的成人中，年龄标化的糖尿病的患病率为9.7％[2]，随着糖尿病治疗药物的研究进展，目前临床使用的糖尿病治疗药物不仅有胰岛素、二甲双胍等传统药物，还有作用于胰高血糖素样肽-1（GLP-1）或二肽基肽酶-4（DPP-4）的两类新型药物，其中二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂由于其作用靶点独特、有效性及安全性俱佳，成为糖尿病药物市场最受关注的一类药物。

DPP-4结构功能

DPP-4由Hopsu-Havu和Glenner在鼠肝脏组织匀浆过程中发现，2003年首次确定了DPP-4蛋白质的三维结构，是体内降解GLP-1，并使其失活的关键酶之一。

DPP-4是一种位于细胞表面的丝氨酸肽酶，广泛存在于血浆、胃肠道、肾脏、淋巴结和结缔组织等体内组织中，其中肾脏最多。其家族成员包括DPP-1、DPP-2、DPP-3、DPP-4、DPP-8、DPP-9和成纤维细胞活化蛋白-α（FAP）。DPP-4的分子量为220ku，活性体为二聚体形式，每个亚单位包含两个结构域，控制底物的出入口位于两个结构域之间的一个大小为30～45A的大型洞穴，其内的袋状结构便是DPP-4的活性部位，凡是结构的N端第二位上是脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）的多肽都是DPP-4发挥活性的主要底物[3]。

DPP-4抑制剂作用机理

由于体内DPP-4的迅速降解作用，GLP-1在体内半衰期很短（＜2min），研究发现当DPP-4活性被抑制后GLP-1的作用时间便有效延长，从而发挥降低血糖水平作用。DPP-4抑制剂作用机理便是基于其结构与天然底物相似，含有Xaa-Pro类似结构，能够竞争性结合DPP-4活性部位，而且亲和力远大于天然底物，因而改变了DPP-4的构象，降低催化活性。实验证明DPP-4抑制剂可在24h内可逆性地抑制大约90％的DPP-4酶活性。因而DPP-4抑制剂能够通过提高体内GLP-1浓度，延长其降糖作用时间，并且抑制胰高血糖素分泌，延长GLP-1对胰岛素分泌的刺激持续时间。因为GLP-1对胰岛素分泌的调节作用呈现严格的血糖浓度依赖性，只有在血糖升高时，GLP-1才会增加胰岛素分泌，所以DPP-4抑制剂不会引起低血糖发生风险。DPP-4抑制剂独特作用机理和良好的安全性特点，成为了糖尿病新药研究的热点领域，目前，已有4个DPP-4抑制剂获得上市批准，并且仍有许多正在开发过程中的化合物。

DPP-4抑制剂结构分类

DPP-4抑制剂首先要求对DPP-4具有较强抑制作用，但是最早发现的一批化合物对相关其他酶如DPP-7、DPP-8和DPP-9也有抑制作用。另外，还要求研发出对DPP-4选择性高的化合物，即兼备对DPP-4的高抑制活性和高选择性，并且作用时间持续，如能保持24h作用，以方便每日1次给药。

通过X线衍射研究发现DPP-4酶分子的结合位点具有高度类药性[4]：催化位点位于较大的空间中，存在由数个芳环侧链形成的亲脂性口袋，从而具有有效的分子锚定位点，有利于设计小分子药物，以实现对酶的紧密特异性结合；另一方面，DPP-4酶的催化位点有两个开口，能够使溶剂进入，调解抑制剂的理化性质，改善药动学特性。正是这些结构特征提供了DPP-4酶结合位点的结构优势，使发现多种不同化学类型的DPP-4抑制剂成为可能。

现有的DPP-4抑制剂根据其化学结构特点，分为两大类别：拟肽类DPP-4抑制剂（α-氨基酸类和β-氨基酸类）和非拟肽类DPP-4抑制剂（嘧啶类、黄嘌呤类等）。

拟肽类抑制剂基于DPP-4的天然底物GLP-1的N端结构片段为化学模拟对象来进行药物设计，得到一类具有类似于脯氨酸结构的化合物，是目前研究最为广泛的一类DPP-4抑制剂，其结构主要由含有杂环的P1位和含有取代氨基侧链的P2位组成。P1与DPP-4的S1疏水口袋结合；P2占据S2口袋。当P2的吡咯烷（或类似结构）所连的羰基的α-位氨基取代，得到含有甘氨酸结构片段的化合物为α-氨基酸类拟肽类DPP-4抑制剂；如果为β-位氨基取代，对应得到含有β-丙氨酸结构片段的化合物则为β-氨基酸类拟肽类DPP-4抑制剂。

与拟肽类DPP-4抑制剂不同，非拟肽类抑制剂结构不存在明显一致性，可分为黄嘌呤类、氨甲基嘧啶类、氨基环己烷、嘧啶酮和烟酰胺类等。

DPP-4抑制剂的构效关系

近些年来，相继有沙格列汀（Saxagliptin），维格列汀（Vildagliptin）和Linagliptin获得上市批准。另外，还有多种处于临床研究阶段的抑制剂分子。下面将对其构效关系进行综述。

1.拟肽类DPP-4抑制剂

1.1 α-氨基酸类DPP-4抑制剂 早期的拟肽类抑制剂模拟DPP-4的天然底物，结构中都含有类似脯氨酸片段。与DPP-4相结合时，P1、P2区分别占据S1和S2口袋，同时氨基与DPP-4中的205位（或206位）谷氨酸形成盐桥，羰基上的氧原子与125位精氨酸形成氢键。由于发现若在P1区吡咯烷C2位引入亲电子基团，如CN，则可与DPP-4的活性部位的630位丝氨酸进一步形成键合，能够增加对DPP-4的抑制活性，但是这样的2-氰基吡咯烷类衍生物在中性和碱性条件下易成环水解而失活，稳定性差。通过研究得到两种方法能够提高稳定性，降低其成环速率，从而得到了今天的上市药物维格列汀和沙格列汀。

一方面，可以通过N端修饰提高稳定性。维格列汀[5]是在P2区的α-氨基氮原子上引入大体积基团，即3-羟基金刚烷基，通过空间位阻效应降低氮原子的反应性，分子内环合的概率降低至原先的1/30，显著提高化学稳定性，对DPP-4的IC50为3.5nmol/L。维格列汀的血浆半衰期为3h，口服生物利用度达到85％。

另一方面，可以在C端进行修饰。百时美施贵宝研发的沙格列汀在P1区氰基吡咯环的C4和C5上引入具有手性环丙基，同时引入3-羟基金刚烷基，阻碍环合反应进行[6]。体外活性研究显示沙格列汀对DPP-4的IC50为3.37nmol/L，稳定性高于维格列汀。沙格列汀的半衰期为2.1h，生物利用度为75％。

1.2 β-氨基酸类DPP-4抑制剂 β-氨基酸类拟肽类DPP-4抑制剂的代表西格列汀是首个获得美国FDA批准上市的DPP-4抑制剂。该类化合物的氨基能与DPP-4分子的第205位谷氨酸（或206位谷氨酸）结合形成盐桥。构效关系表明：当β-氨基与其手性碳原子的构象为R型时活性优于S型；而R基必须是苯环，若用芳杂环或环烷基取代则活性会下降，苯环上引入较小的取代基团（如氟）活性增强，而且多氟取代物的活性高于单氟取代物；分子结构中的杂环多为吡咯烷、噻唑烷、哌嗪或三唑并哌嗪环。在杂环或芳杂环上引入适当的取代基会增强药效活性。

西格列汀的结构中2,4,5-三氟苯基能够较好地占据S1疏水口袋，产生疏水作用，4位的氟原子与Asn710和Arg125相互作用形成氢键；羰基的氧原子与Tyr547通过水分子形成桥连；（R）-氨基与2个谷氨酸残基Glu205、Glu206发生氢键相互作用；该保守性氢键与底物的N端和DPP-4结合作用类似；三唑哌嗪环与Phe357的侧链还能产生π-π相互作用；三氟甲基与Arg358和Ser209分别形成氢键，与所处的口袋结合十分紧密，当除去该基团或被更大的取代基取代时，活性都有所下降，故表明此位点的最佳大小基团便是三氟甲基[7]。对西格列汀的体外抑酶活性试验研究结果为西格列汀对DPP-4的IC50为18nmol/L。药动学研究显示，口服100mg剂量后迅速吸收，1～4h后血浆药物浓度达峰值，血药AUC与剂量成比例，半衰期为12.4h，有16％被代谢。一项为期18周的研究表明，西格列汀单药治疗能够改善HOMA-β指数和胰岛素原/胰岛素比值（与安慰剂相比12.1％ vs 1％；-0.05 vs 0.07）。

还有后续多项研究对西格列汀结构进行了相应改造，寻找新型药物分子。Shan等改变三唑环中氮原子的位置[8]，得到1,2,3-三唑并哌嗪化合物，对DPP-4的IC50为50nmol/L。大鼠实验药动学性质良好，半衰期为2.53h，Cmax965μg/L。在ICR小鼠OGTT试验中，该化合物能降低最高血糖水平约31％。若将三唑并哌嗪环替换为吡咯烷，并在吡咯烷的C2位引入大基团，那么得到的化合物体外抑酶活性为IC506.3nmol/L[9]。ob/ob小鼠的OGTT试验中血糖峰值降低15％。Kim对三唑并哌嗪环进行替代，以哌嗪-2-酮替代后得到DA-1229[10]，IC50为0.9nmol/L，大鼠体内半衰期6.1h，生物利用度为74.8％，并且已进入Ⅱ期临床试验阶段。

2.非拟肽类DPP-4抑制剂

2.1 黄嘌呤类 黄嘌呤衍生物DPP-4抑制剂活性较强，该类化合物中已有Linagliptin获批上市。该药物是首先在高通量筛选得到的先导化合物BDPX后进行有效关系研究并改造后得到的。BDPX分子的母环的结构不固定，与Tyr547形成疏水作用，是非活性必须的，可用其他稠杂环替代，如尿嘧啶、咪唑和三唑环等；7位N上的取代基是活性必须的，多为苄基、2-丁烯基或2-丁炔基，而且在苄基2位引入氰基使活性提高；另外，还需要8位哌嗪或3-氨基哌啶取代基与S2口袋的Glu205形成保守性氢键。在黄嘌呤的N-1位引入疏水性基团后还可与Trp629作用，提高与DPP-4的结合力[11]。实验证明Linagliptin对DPP-4的IC50为1nmol/L，而且属于长效DPP-4抑制剂，作用长达24h。

2.2嘧啶类 嘧啶类抑制剂是由黄嘌呤类衍生物经结构改造而得到的非拟肽类抑制剂，将黄嘌呤骨架跃迁为嘧啶后再进行结构修饰，其与DPP-4的结合模式与黄嘌呤类相似。由日本武田制药研制的阿格列汀[12]结构内的嘧啶酮部分与Tyr547形成π-π相互作用，嘧啶酮的羰基与Tyr631形成氢键；并在杂环上连接N取代氨基苄基，与Arg125产生氢键，苯环与Tyr622产生疏水作用，还有氨基哌啶与Glu205形成氢键。阿格列汀的体外活性研究显示，其对DPP-4的IC50为7nmol/L，口服半衰期为12.3～21h。

结 语

随着药物研发和临床研究的发展，越来越多的DPP-4抑制剂进入临床使用或临床研究阶段，为2型糖尿病患者的治疗提供了一个较已有治疗药物具有特定方面优势的选择，如在降低血糖的同时保护B细胞功能，低血糖风险低而且不会引起体重增加。但是，在研发中仍存在维持化合物活性和提高选择性的矛盾，在临床用药中仍面临着有效性与长期安全性评估的重大挑战，需要进行更深入的研究，来为2型糖尿病患者提供更有效安全的DPP-4抑制剂药物治疗。

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