西格列汀联合甘精胰岛素治疗对2型糖尿病Nrf2及氧化应激的影响

陈传绮　罗千军　鄢燕琼　庄严

【摘要】 目的 研究西格列汀联合甘精胰岛素治疗对2型糖尿病患者核因子E2相关因子2（Nrf2）及氧化应激的影响。方法 选取100例2型糖尿病患者， 随机分为西格列汀组和甘精胰岛素联合西格列汀组， 每组50例;另选取健康体检者50例作为对照组。西格列汀组采用西格列汀治疗， 甘精胰岛素联合西格列汀组采用西格列汀联合甘精胰岛素治疗， 收集两组患者治疗前后及对照组研究对象血液进行检测， 观察三组血糖、血脂及血清Nrf2、抗氧化酶[谷胱甘肽S转移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）、血红素氧合酶-1（HO-1）、NAD（P）H：醌氧化还原酶1（NQO1）] 水平， 以及外周血单核细胞（PBMC）中HO-1/β-肌动蛋白信使核糖核酸（β-actin mRNA）表达率的差异。结果 治疗前， 西格列汀组及甘精胰岛素联合西格列汀组患者空腹血糖（FPG）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、糖化血红蛋白（HbA1c）水平均明显高于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）;且兩组比较差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后， 西格列汀组及甘精胰岛素联合西格列汀组患者FPG、HbA1c、TG、TC、LDL-C水平均低于治疗前且甘精胰岛素联合西格列汀组的FPG、TG、TC、LDL-C、HbA1c水平分别为（6.41±0.62）mmol/L、（1.61±0.54）mmol/L、（4.65±0.72）mmol/L、（3.11±0.51）mmol/L、（6.93±0.52）%均低于西格列汀组的（6.93±0.54）mmol/L、（1.82±0.41）mmol/L、（4.98±0.88）mmol/L、（3.37±0.75）mmol/L、（7.63±0.64）%， 差异具有统计学意义（P<0.05）。西格列汀组和甘精胰岛素联合西格列汀组患者治疗前SOD、GST水平明显低于对照组， Nrf2、NQO1、HO-1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表达率显著高于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。与本组治疗前比较， 西格列汀组和甘精胰岛素联合西格列汀组患者治疗后血清Nrf2、HO-1、NQO1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表达率均明显降低， GST、SOD水平升高， 差异具有统计学意义（P<0.05）;治疗后， 甘精胰岛素联合西格列汀组患者较西格列汀组患者血清Nrf2、HO-1、NQO1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表达率降低更为明显， GST、SOD水平升高明显， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 西格列汀联合甘精胰岛素治疗较单用西格列汀治疗， 对于2型糖尿病的血糖、血脂等改善效果更好。西格列汀联合甘精胰岛素治疗能够抑制2 型糖尿病患者Nrf2的表达， 其可能通过Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）-Nrf2/抗氧化反应元件（ARE）信号通路对2型糖尿病患者氧化应激产生影响， 使Nrf2下游HO-1、NQO1等抗氧化酶活性受到调节， 血清GST、SOD水平升高， 值得临床注意。

【关键词】 西格列汀;甘精胰岛素;2型糖尿病;核因子E2相关因子2;Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件信号通路

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.24.060

2型糖尿病是全世界性的公共健康问题， 中国是世界上拥有最多糖尿病患者的国家之一[1， 2]。研究表明糖尿病与氧化应激有着密切的联系[3， 4]。Keap1-Nrf2- ARE信号通路是近年来抗氧化研究领域的热点[5]。本文就西格列汀联合甘精胰岛素治疗对2型糖尿病患者Nrf2及氧化应激的影响进行研究， 探讨其分子生物学机制， 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2014年6月～2016年6月在本院糖尿病中心门诊和住院部诊治的2型糖尿病患者共100例， 其中男58例， 女42例;年龄58～74岁， 平均年龄66.4岁。所有患者符合1999年世界卫生组织（WHO）糖尿病诊断标准， 患者入院前未给予降糖药物治疗， 无糖尿病酮症酸中毒等严重糖尿病急性并发症， 无严重的心脏疾病、活动性肝病、不稳定或快速进展的肾脏疾病， 无严重的周围血管病及脑血管疾病， 排除糖尿病病情较重需胰岛素强化治疗者。另在本院体检中心选取同期健康体检者50例， 其中男26例， 女24例;年龄55～72岁， 平均年龄64.0岁。将100例糖尿病患者随机分为西格列汀组和甘精胰岛素联合西格列汀组， 每组50例。

1. 2 方法

1. 2. 1 糖尿病患者治疗方法 西格列汀组采用西格列汀治疗， 给予患者口服西格列汀片100 mg/次， 1次/d。甘精胰岛素联合西格列汀组采用西格列汀联合甘精胰岛素治疗， 给予患者口服西格列汀片100 mg/次， 1次/d， 联合每晚10点皮下注射1次甘精胰岛素， 根据患者体重计算所需甘精胰岛素剂量并根据患者血糖情况调整胰岛素剂量[6， 7]。两组患者治疗时间均为12周， 每2周门诊随访1次。治疗前及治疗12周后各收集患者静脉血液样本15 ml。

1. 2. 2 血糖及血脂检测 西格列汀组、甘精胰岛素联合西格列汀组患者治疗前后及对照组入院时分别抽取静脉血5 ml，

采用葡萄糖氧化酶法测定FPG， 采用化学发光法测定TG、TC、LDL-C， 采用高效液相色谱分析法测定HbA1c。检测采用美国BeckmanLS20全自动生化分析仪进行。

1. 2. 3 Nrf2及血清抗氧化酶检测 西格列汀组、甘精胰岛素联合西格列汀组患者治疗前后及对照组入院时分别抽取静脉血5 ml， 采用12000 r/min离心25 min， 吸取上清液后， 分装， 标本保存于-70℃冰箱。双抗夹心酶联免疫吸附法检测两组患者血清中Nrf2及抗氧化酶（GST、SOD、HO-1、NQO1）水平。试剂盒购自南京建成生物工程研究所， 按试剂盒说明进行双抗夹心酶联免疫吸附法检测Nrf2及血清抗氧化酶水平。

1. 2. 4 PBMC中HO-1/β-actin mRNA的表达率检测 西格列汀组、甘精胰岛素联合西格列汀组患者治疗前后及对照组入院时分别抽取静脉血5 ml， 装于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝真空采血管中。采用逆转录-聚合酶链反应法检测PBMC中HO-1/β-actin mRNA的表达率。分别应用淋巴细胞分离液分离PBMC， 用Trizol抽提液提取总RNA， 使用逆转录试剂盒（Takara公司生产）， 采用Primer5.0软件设计引物， HO-1的上游引物为5， -CTGGAGGAGGAGATTGAGCG-3， 下游引物为5， -TAAGGACCCATCGGAGAAGC-3。按试剂盒方法操作进行逆转录-聚合酶链反应， 加溶解曲线， 光密度值由计算机软件计算得出。分析三组PBMC中HO-1/β-actin mRNA的表达率。

1. 3 观察指标 观察三组血糖及血脂与血清Nrf2、GST、SOD、HO-1、NQO1水平， 以及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表达率的差异。血糖及血脂指标包括FPG、HbA1c、TG、TC、LDL-C。

1. 4 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 三组研究对象血糖及血脂水平比较 治疗前， 西格列汀组及甘精胰岛素联合西格列汀组患者FPG、HbA1c、TG、TC、LDL-C水平均明显高于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）;且两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后， 西格列汀组及甘精胰岛素联合西格列汀组患者FPG、HbA1c、TG、TC、LDL-C水平均低于治疗前且甘精胰岛素联合西格列汀组的FPG、TG、TC、LDL-C、HbA1c水平分别为（6.41±0.62）mmol/L、（1.61±0.54）mmol/L、（4.65±0.72）mmol/L、（3.11±0.51）mmol/L、（6.93±0.52）%均低于西格列汀组的（6.93±0.54）mmol/L、（1.82±0.41）mmol/L、（4.98±0.88）mmol/L、（3.37±0.75）mmol/L、（7.63±0.64）%， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 三组研究对象血清Nrf2、GST、SOD、HO-1、NQO1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表达率比较 西格列汀组和甘精胰岛素联合西格列汀组患者治疗前SOD、GST水平明显低于对照组， Nrf2、NQO1、HO-1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表达率显著高于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。与本组治疗前比较， 西格列汀组和甘精胰岛素联合西格列汀组患者治疗后血清Nrf2、HO-1、NQO1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表达率均明显降低， GST、SOD水平升高， 差异具有统计学意义（P<0.05）;治疗后， 甘精胰岛素联合西格列汀组患者较西格列汀组患者血清Nrf2、HO-1、NQO1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表达率降低更为明显， GST、SOD水平升高明显， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

氧化應激与2 型糖尿病及其并发症发生发展密切相关， 氧化产物过多可导致胰岛B细胞损伤， 而改善体内的氧化应激状态可能防止2型糖尿病及其并发症进展[8]。Keap1-Nrf2-ARE信号通路是迄今为止发现的细胞内最重要的抗氧化应激系统。Nrf2通过与ARE相互作用调节编码抗氧化蛋白， 非刺激状态Nrf2在细胞质中与Keap1结合， 在自由基或化学物质刺激下， Nrf2与Keap1解离而活化。Nrf2进入细胞核与ARE结合， 启动ARE下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白等基因的转录和表达 [9]。ARE下游的抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶包括HO-1、NQO1、GST、SOD等。HO-1是体内参与亚铁血红素代谢的一种微粒体氧化酶， 对氧化应激的细胞起保护作用， 可减少糖尿病患者细胞的损伤和凋亡， 延缓糖尿病及并发症的发生发展[10]， 其在正常组织中表达甚微， 但在氧化应激状态下大量生成， 从而产生上述作用， 一般随着氧化应激缓解， 其水平随之下降。SOD 具有较强的清除氧自由基和炎症因子的作用， 从而保护机体免受损伤[11]。

甘精胰岛素是使用DNA重组技术制备的长效胰岛素类似物。外源性胰岛素除了具有降糖作用， 还具有抗氧化应激作用[12]。陶松桔等[13]研究证实， 胰岛素强化治疗在控制糖尿病患者血糖的同时， 还可以提高血清 SOD水平。西格列汀是首个应用于临床的二肽基肽酶4（DPP-4）抑制剂， 是2型糖尿病治疗的一线药物。Jin等[14]的研究表明， DPP-4抑制剂能提高胰岛细胞SOD的水平， 改善氧化应激状态。

本研究表明， 西格列汀组和甘精胰岛素联合西格列汀组患者治疗前SOD与GST水平明显低于对照组， Nrf2、NQO1、HO-1水平显著高于对照组（P<0.05）。分析原因：随着Nrf2信号通路的激活， Nrf2、NQO1、HO-1表达的增加可能导致机体抗氧化应激能力的增强， 进而起到清除氧自由基及炎症因子作用;2 型糖尿病患者机体的长期高血糖可与SOD 活性中心的赖氨酸结合， 产生糖基化反应， 使SOD 水平下降， 谷胱甘肽合成酶糖化， GST水平也随之下降。上述指标变化提示2型糖尿病患者体内存在明显的氧化应激状态。

与治疗前比较， 西格列汀组和甘精胰岛素联合西格列汀组患者治疗后血清Nrf2、HO-1和NQO1水平均明显降低， GST、SOD水平升高， 且甘精胰岛素联合西格列汀组患者治疗后上述指标较西格列汀组改变更为明显（P<0.05）。2型糖尿病患者血糖控制后， Nrf2、HO-1和NQO1水平随之降低， 提示患者在血糖控制的同时， 降低了Nrf2及其通路下游 HO-1、NQO1的表达， 从而使体内氧化应激改善， 同时改善胰岛素抵抗;随着血糖的正常， 内源性血清GST、SOD抑制状态解除， 水平也趋于正常， 从而减少全身炎症反应。糖尿病患者应用甘精胰岛素联合西格列汀治疗后血清抗氧化酶的改变更为明显， 提示二者联合治疗对糖尿病患者体内的氧化应激状态改善更为显著。

PBMC中HO-1/β-actin mRNA基因表达率的改变与血清HO-1的变化一致， 进一步提示甘精胰岛素联合西格列汀治疗通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路改善糖尿病患者机体的氧化应激状态。

综上所述， 西格列汀联合甘精胰岛素治疗较单用西格列汀治疗， 对于2型糖尿病的血糖、血脂等改善效果更好。西格列汀联合甘精胰岛素治疗能够抑制2型糖尿病患者Nrf2的表达， 其可能通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路调节2型糖尿病患者的氧化应激状态。Keap1-Nrf2-ARE信号通路可能成为防治2型糖尿病患者一个非常有前景的靶点。

参考文献

[1] Nie F， Wu D， Du H， et al. Serum klotho protein levels and their correlations with the progression of type 2 diabetes mellitus. J Diabetes Complications， 2017， 31（3）：594-598.

[2] Ozguven MA， Karacalioglu AO， Ince S， et al. Altered biodistribution of FDG in patients with type-2 diabetes mellitus. Ann Nucl Med， 2014， 28（6）：505-511.

[3] 任春久， 张瑶， 崔为正， 等. 氧化应激在2型糖尿病发病机制中的作用研究进展. 生理学报， 2013， 65（6）：664-673.

[4] Das P， Biswas S， Mukherjee S， et al. Association of Oxidative Stress and Obesity with Insulin Resistance in Type 2 Diabetes Mellitus. Mymensingh Med J， 2016， 25（1）：148-152.

[5] Zhou T， Zong R， Zhang Z， et al. SERPINA3K protects against oxidative stress via modulating ROS generation/degradation and KEAP1-NRF2 pathway in the corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci， 2012， 53（8）：5033-5043.

[6] 龚健， 胡欣， 张峰. 西格列汀联合甘精胰岛素治疗老年2型糖尿病的临床观察. 中华保健医学杂志， 2013， 15（2）：175.

[7] 刘春军， 严悦， 杨德庆. 磷酸西格列汀联合甘精胰岛素治疗老年2型糖尿病临床疗效分析. 临床药物治疗杂志， 2016， 14（1）：51-53.

[8] 戴青原， 郭濤. 氧化应激与糖尿病及动脉粥样硬化研究进展. 心血管病学进展， 2013， 34（5）：664-668.

[9] Lee JS， Surh YJ. Nrf2 as a novel molecular target for chemoprevention. Cancer Lett， 2005， 224（2）：171-184.

[10] Da Silv JL， Stoltz RA， Dunn MW， et a1. Diminished heme oxygenase-1mRNA expression in RPE cells from diabetic donors as quantitated by competitive RT-PCR. Curr Eye Res， 1997， 16（4）：380-386.

[11] Mansuroglu B， Derman S， Yaba A， et al. Protective effect of chemically modified SOD on lipid peroxidation and antioxidant status in diabetic rats. Int J Biol Macromol， 2015， 72（1）：79-87.

[12] Palma HE， Wolkmer P， Gallio M， et al. Oxidative stress parameters in blood， liver， and kidney of diabetic rats treated with curcumin and/or insulin. Mol Cell Biochem， 2014， 38（2）：199-210.

[13] 陶松桔， 尹支农. 短期胰岛素泵强化治疗对新诊断2型糖尿病患者胰岛素抵抗的影响及其抗氧化机制. 中国现代医学杂志， 2011， 21（4）：457-460.

[14] Jin L， Sun WL， Doh KC， et al. Dipeptidyl Peptidase Ⅳ Inhibitor MK-0626 Attenuates Pancreatic Islet Injury in Tacrolimus-Induced Diabetic Rats. Kidney Research & Clinical Practice， 2014， 33（2）：A6-A7.