局部外用酞丁安软膏后皮内浓度测定

吴黎莉 陈 沄 隗慧林 徐兰芳 佘晓东 沈珑瑛 潘显道

酞丁安(ftibamzone)为我国首创的双缩氨基硫脲类抗病毒药，它不能直接抑制疱疹病毒Ⅱ型DNA多聚酶，也不能直接灭活疱疹病毒，但可抑制病毒DNA和早期蛋白质合成［1，2］;酞丁安对沙眼衣原体、HSV －1和HSV－2有强效抑制作用;此外，体外对金黄色葡萄球菌(包括青霉素高度耐药的菌株)、链球菌、肺炎双球菌等都有抑制作用，对皮肤癣菌具有一定抗真菌作用。研究表明酞丁安软膏在大鼠局部皮肤上的毒性较低［3］。临床给药以局部外用为主，剂型有滴眼剂、搽剂、软膏剂等，治疗各型沙眼、单纯疱疹、带状疱疹、尖锐湿疣、浅部真菌感染(体癣、股癣、手足癣等)。为了解酞丁安皮肤局部给药后，药物的皮肤渗透及进入皮内的药物浓度水平，本试验采用匀浆法结合高效液相色谱，测定试验乳猪皮肤给药后皮内药物浓度。

材料与方法

1．仪器与试剂:MS－1515高效液相色谱仪(美国Waters公司，配备M－2487紫外检测器，7725i限量进样阀，Breeze色谱管理系统)。酞丁安对照品(北京协和药厂提供，批号050801，纯度81%，避光保存)。酞丁胺软膏(北京协和药厂，批号060304，10g∶0．1g，标示浓度1%)。N，N － 二甲基甲酰胺为分析纯，甲醇、乙腈均为色谱纯，三蒸水自制。

2．实验动物:苏中猪:江苏省农科院动物中心提供，刚断乳小猪(20～30天，5．5～6．5kg)，合格证苏01证字第01号。

3．方法:(1)酞丁安对照品液的配制:精密称取酞丁安对照品6mg，置50ml棕色容量瓶，加1ml N，N－二甲基甲酰胺，完全溶解后加甲醇定容，备用。(2)色谱条件:色谱柱:Agilent zorbax SB－ C18(250mm ×4．6mm ID，5μm);流动相:甲醇∶水(55∶45);流速:1ml/min;紫外检测波长:347nm;进样量 20μl;柱温为室温。(3)皮肤样本处理:剪取给药部位中心区域皮肤，去除皮下组织后称重、剪碎成皮肤匀浆，置具塞试管。加1ml提取液(甲醇－N，N－二甲基甲酰胺49∶1)置4℃冰箱浸泡过夜。3000转离心10min，上清液20μl进样分析。(4)方法的特异性:酞丁安与皮肤中的杂质可完全分离，皮肤中的内源性杂质不干扰酞丁安的测定。酞丁安对照品液(0．25μg/ml)、空白皮肤、试验动物破损皮肤外用给药1h后皮肤处理液的典型色谱图见图1。(5)线性范围:精密量取酞丁安对照品液适量，分别用流动相稀释成 0．02、0．05、0．1、0．2、0．5、1、2μg/ml的进样溶液。进样后记录色谱图，以酞丁安峰面积值A对样品浓度C进行线性回归，得回归方程:A=55734×C－631．44，r=0．9999。表明酞丁安在0．02 ～2μg/ml范围内峰面积与浓度线性范围良好。(6)精密度试验:精密量取酞丁安对照品液适量，分别用流动相稀释成0．2、2μg/ml的进样溶液。进样后记录色谱图，以酞丁安峰面积值计算测定精密度。结果表明用本法测定酞丁安浓度精密度良好，RSD分别为0.86%和3．2%。(7)稳定性考察:精密量取酞丁安对照品液适量，置棕色容量瓶，用流动相稀释成8μg/ml的进样溶液。分别正常日光放置及避光放置。于 0、2、4、6、8、10、25h 取样进行色谱分析。结果表明正常日光下酞丁安的稳定性较差，酞丁安的峰面积值随光照时间的延长，不断地下降。采取避光措施后，酞丁安溶液的药物浓度在10h内能保持基本稳定(图2)。

4．试验设计:(1)完整皮肤的经皮渗透及皮内药物浓度测定:乳猪两只，实验前30min 30%氨基甲酸乙酯溶液(3ml/kg)腹腔注射麻醉，成功后固定。背部两侧正常皮肤剃除毛发后在预定区域分别于 0、2、3、4、5h 给 1% 酞丁安软膏约 0．1g，给药面积约2cm×2cm。全部区域给药完毕后1h，处死动物。涂药部位皮肤分别用1%N，N－二甲基甲酰胺水溶液仔细搽洗3次，取皮。另取未给药部位皮肤及涂药后立即洗净皮肤，分别作空白对照和搽洗对照。乳猪背部给药区域见图3。(2)破损皮肤的经皮渗透及皮内药物浓度测定:另取乳猪两只，实验前30min 30%氨基甲酸乙酯溶液(3ml/kg)腹腔注射麻醉，成功后固定。背部两侧皮肤剃除毛发后用梅花针敲击50次，表皮微红、轻度渗出。同上述正常皮肤试验给药。全部区域给药完毕后1h，处死动物。涂药部位皮肤分别用1%N，N－二甲基甲酰胺水溶液仔细搽洗3次，取皮。另取敲击后破损皮肤的未给药部位及涂药后立即洗净部位，分别作空白对照和搽洗对照。(3)皮内药物浓度计算:将完整皮肤与破损皮肤经皮渗透试验所得各皮肤样本，按“皮肤样本处理”项下皮肤样本处理方法处理后进样分析，计算提取液中药物浓度C(μg/ml)。根据以下公式计算不同时间点皮内药物浓度C皮内(μg/g):C皮内=C×V/W(其中V为提取液体积，W为去除皮下组织后皮肤样本重量)。

图3 乳猪背部给药区域示意图

结 果

完整皮肤及破损皮肤局部涂搽1%酞丁安软膏后，不同时间采集的皮肤样本药物浓度测定结果见表1，皮内浓度－时间曲线图见图4。皮肤组织药物浓度测定结果表明，酞丁安软膏外用于皮肤后，确实有一定量的经皮吸收和渗透，但是吸收量相对较低。完整皮肤用药后至6h，皮肤组织药物浓度基本维持在0．5μg/g以下。

表1 酞丁胺皮内浓度测定结果(n=4，μg/g)

表1 酞丁胺皮内浓度测定结果(n=4，μg/g)

时间(h)完整皮肤 破损皮肤0－－1 0．5322 ±0．1898 0．3142 ±0．2606 2 0．2810 ±0．1346 0．5645 ±0．4369 3 0．6649 ±0．6282 0．4424 ±0．2730 4 0．3580 ±0．1324 0．2670 ±0．0830 6 0．3116 ±0．1667 1．9623 ±1．0077

讨 论

图4 局部外用1%酞丁安软膏后的皮内药物浓度

根据以往研究报道，本文选用甲醇－水体系为流动相，以347nm为紫外测定波长，在此条件下酞丁安色谱峰峰形对称，准确度高，精密度与重现性好。内源性的物质不干扰酞丁安皮内浓度的测定［4～6］。

不同种属动物的皮肤组织结构不尽相同，而猪的皮肤大体解剖上与人类十分相似。有学者研究探讨了不同种属动物皮肤对化学物质的通透性，包括无毛小鼠、大鼠、家兔、小猪、豚鼠、恒河猴等，结果表明小猪皮肤对药物渗透性与人体皮肤最为接近，大鼠和家兔的皮肤通透性明显高于人类和小猪，用小猪进行经皮吸收试验可很好地预期人经皮吸收药物结果。因此酞丁安的经皮吸收试验选用乳猪作为实验动物［7］。

理论上用梅花针将表皮敲至微红和轻度渗出，减少或消除了角质层对药物经皮渗透的屏障作用，因此破损皮肤的药物经皮渗透应高于完整皮肤。但本研究结果表明皮肤表皮的完整程度在给药初期对药物的经皮渗透影响不大，破损皮肤外用给药后1～4h的皮肤组织药物浓度水平与完整皮肤无明显差异。值得注意的是破损皮肤外用给药6h后，皮肤组织的药物浓度明显增加，高于完整皮肤的数倍。这一结果产生的原因可能是由于外用半固体制剂后，药物首先要从基质中释放出来才能进一步经皮吸收。而药物的释放与化合物结构、理化性质及基质辅料成分有关，药物的释放量高是药物经皮吸收程度高的前提条件。如果药物的释放较为缓慢，就可能出现经皮吸收高峰滞后的现象。虽然此时皮肤组织的药物浓度明显增加，但透过皮肤进入系统循环的药量仍然较少，皮肤作为药物的储库作用较为明显。

1 杨亚军，赵敬华，潘显道．抗病毒药酞丁安及其衍生物构效关系研究进展［J］．医学研究杂志，2007，36(12):13 －14

2 Yang YJ，Zhao JH，Pan XD，et al．Synthesis and antiviral activity of phthiobuzone analogues［J］．Chem Pharm Bull(Tokyo)，2010，58(2):208－211

3 李新宇，高纪伟，徐兰芳，等．酞丁安乳膏在大鼠局部皮肤上的毒理实验［J］．华西药学杂志，2009，24(2):168－170

4 梁记芯．高效液相色谱法测定酞丁安滴眼液的含量［J］．海峡药学，2006，18(2):80－82

5 余小平．高效液相色谱法测定酞丁安软膏的含量［J］．药物分析杂志，2005，25(3):356－357

6 陈建琴，陈秋虹．高效液相色谱法测定酞丁安搽剂的含量［J］．中国医院药学杂志，2003，23(10):604－606

7 陈华．小型猪在毒理学研究中的应用［J］．中国比较医学杂志，2003，13(3):175－178